RAB27B在宮頸癌干細胞中的作用研究

張科 陳潔 毛聿華 豐為 羅敏

1南方醫科大學第一臨床醫學院（廣州 510515）；2中國人民解放軍南部戰區總醫院婦產科（廣州 510000）

宮頸癌是育齡期女性常見的惡性腫瘤之一，常規的治療方法為手術治療輔以放療、化療或靶向治療等，早期患者獲益較大。近年來，相關研究［1-2］表明，其高復發率及轉移率可能與宮頸癌干細胞有關，即干細胞是宮頸癌復發、轉移的種子細胞。因此尋找宮頸癌干細胞的發生發展機制，為晚期、復發及耐藥患者提供更加有效的治療手段意義重大。研究發現，腫瘤的側群細胞（SPs）具有明顯的干性特質，較非側群細胞（NSPs）具有明顯的增殖、侵襲及成球克隆能力，成為研究干細胞的一種有效的替代工具。且發現SP 細胞高表達ABCG2，而ABCG2 基因被認為是干細胞標志基因，與腫瘤耐藥息息相關。研究［3］證實，利用流式分選及無血清細胞成球培養方法可以從Hela 及Siha 細胞中分離出SP 細胞，通過驗證發現SP 細胞具有明顯的干性特征，故而將SP 細胞作為宮頸癌干細胞的替代細胞進行研究。

RAB 蛋白可以調節腫瘤的增殖，與腫瘤的轉移、侵襲也有一定的關系，這種調節作用一般通過調控細胞囊泡的分泌、轉運等發揮作用［4-5］。研究發現RAB27B 與胰腺癌［6］、前列腺癌［7-8］、乳腺癌［9-10］、卵巢癌［11］、肺癌［12-13］、肝癌［14-15］、食管癌［16］等多種癌癥的復發、轉移及耐藥相關。且文獻表明RAB 蛋白與結直腸癌干細胞［17］、乳腺癌干細胞［18］、膠質瘤干細胞［19］干性維持具有一定的調控作用。單細胞轉錄組測序進行相關差異基因功能富集分析后發現宮頸癌非側群細胞與側群細胞相比，與囊泡分泌相關的RAB27B具有顯著的差異性。故本文通過敲除RAB27B在宮頸癌SP 細胞中表達而探討RAB27B 與宮頸癌干細胞的相關關系。同時，通過單細胞轉錄組測序進行相關差異基因分析后發現宮頸癌非側群細胞與側群細胞相比，分泌性卷曲蛋白SFRP1 在二者間表達具有顯著的差異性，且研究發現RAB 蛋白以GTP 核苷酸依賴的方式介導SFRP1 的轉運和分泌，而Rab?SFRP1?Wnt 軸可以作為減弱肺癌干性的潛在靶點［20］，故本文初步探討RAB27B 與分泌性卷曲蛋白SFRP1 的相互作用，為確定宮頸癌干細胞的靶向治療提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料來源人宮頸癌SiHa 細胞系，由中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心提供。人宮頸癌SP 細胞由流式分選側群細胞所得。

1.2 主要試劑1999經濟裝三對siRNA?RAB27B+陰性對照+轉染對照及RiboFECT CP Transfection Kit（166T）購自銳博生物［4］；CCK8 試劑盒購自南京凱基；q?PCR 試劑購自艾科瑞；引物購自擎科生物；抗體SFRP1、RAB27B 均購自美國proteintech 公司，二抗購自弗德生物。

1.3 方法

1.3.1 細胞轉染接種4×105～20×105個細胞至含有適量完全培養基的6 孔板培養孔中，使轉染時的細胞密度達到30%～50%。于室溫無菌超凈臺內［5］用30 μL 1X riboFECTTMCP Buffer 稀釋1.25 μL 20 μmol/L siRNA 儲存液，并用移液槍吹打均勻。再于稀釋好的儲存液中加入3 μL riboFECTTMCP Reagent，并混合均勻，室溫條件下靜置15 min。將6 孔板中原培養基吸凈棄去，后加入riboFECTTMCP混合液，上下左右法輕輕混勻。將培養板置于37 ℃的CO2培養箱中培養24～48 h。

1.3.2 蛋白免疫印跡法（Western blot）檢測細胞目的基因的蛋白表達提取所需樣品細胞的蛋白并用BCA法測定蛋白濃度；按照30 μg蛋白上樣，室溫條件下進行，設置濃縮膠電壓為80 V，分離膠電壓為120 V，恒壓電泳至溴酚藍條帶接近膠底部；按照海綿/3 層濾紙/膠/膜/3 層濾紙/海綿的順序進行放置，裝配成“三明治”狀，后將整個轉膜槽置于冰水中，打開電源，設置電流恒定在250～300 mA，按實際需要調整時間為60～120 min；轉膜后，5%脫脂奶粉（1 g 脫脂奶粉+20 mL PBS 配置）室溫封閉1 h，相應抗體4 ℃孵育過夜（一抗：標準抗體稀釋液=1∶1 000）；次日PBS 洗滌3 遍，10 min/次；后二抗（二抗原液：封閉液=1∶10 000）［6］室溫孵育1 h 后再次PBS 洗滌；使用化學發光法進行條帶發光顯影，選擇β?actin 作為內參對照，選擇合適曝光時間進行拍照保存。

1.3.3 q?PCR 檢測細胞目的基因的mRNA 表達提取各組細胞的RNA 并測定濃度；將RNA 產物及5×Evo M?MLVRT Master Mix 配制成為10 μL 體系后，在PCR 儀上以37 ℃15 min，85 ℃5 s 完成RNA反轉錄cDNA；將cDNA、目標分子上下游引物、2×SYBR?GreenProTaqHSPremix 按照比例混合，再在real time 7500 fast 儀器上以95 ℃5 s 、58 ℃20 s 、72 ℃30 s 共40 個循環的程序完成qPCR。（RAB27B上游引物序列：GACACTGCGGGACAAGAGC，下游引物序列：CTTGCCGTTCATTGACTTCC；SFRP1 上游引物序列：5'?CTTCTACTGGCCCGAGATGCTT?3'，下游引物序列：5'?ATGGCCTCAGATTTCAACT?CGT?3'；GAPDH 上游引物序列：5'?CAGTCAGCCG?CATCTTCTT?3'，下游引物序列：5'?GACAAGCTTC?CCGTTCTCAG?3'。）

1.3.4 Transvell 實驗檢測細胞侵襲能力將轉染NC 及si 片段48 h 的細胞收集并計數，接種2 × 105細胞/200 μL 于Transwell 小室內，小室外24 孔板內加入500 μL 的完全培養基，37 ℃的CO2恒溫馥孵育箱孵育24 h 后取出24 孔板，將小室置于PBS 中輕輕漂洗，并用棉球將微孔膜上層細胞輕輕拭去，后置于4%多聚甲醛中固定20 min；PBS 中輕輕漂洗并吸水紙吸干；后置于0.5%結晶紫（PBS 配［7］置）染色20 min；PBS 中輕輕漂洗并晾干，顯微鏡下觀察并取多個視野拍照計數。

1.3.5 CCK8 實驗檢測細胞增殖能力將轉染NC及si 片段48 h 的細胞收集并計數，接種3 000 個細胞到96 孔板中，加入100 μL 完全培養基，37 ℃的CO2培養箱培養過夜。后于室溫無菌超凈臺內將96 孔板待測孔中原培養基吸凈棄去，并于待測孔中加入100 μL 溶液（10 μL CCK8 試劑+90 μL 全培溶液配制），注意配制及加樣過程應全程避光，后置于5%CO237 ℃恒溫培養箱中孵育1 h，用酶標儀避光條件下測定細胞在450 nm處的吸光度值［8］。并于第2、3、4、5 天同樣操作測吸光度。

1.3.6 平板克隆實驗檢測細胞的克隆形成能力將各組細胞接種于6 孔板中，接種細胞數目為3 000個/孔，完全培養基進行培養［9］，4 d 更換一次培養基，接種14 d 后，洗滌、固定、染色，隨后用數碼照相機拍照。

1.3.7 免疫熒光檢測RAB27B 及SFRP1 的表達及細胞亞定位情況 取出樣品，用無菌PBS 緩沖液搖床上洗滌2～3 次，每次5 min；4%多聚甲醛固定15 min；1%BSA/0.5%Triton X?100 配置的通透液通透封閉30 分鐘。用抗體稀釋緩沖液（1XPBS/1%BSA/0.3% Triton X?100）配制RAB27B、SFRP1 一抗溶液，摸索最佳濃度均為1∶200，倒掉孔中通透封閉液，適量PBS 洗滌，每個孔中加入配制好的一抗溶液200 μL，于4 ℃冰箱孵育過夜。次日，將孔中一抗溶液按標簽回收，PBS 緩沖液搖床洗滌，每次5 min，共3 次。后加入抗體稀釋緩沖液配制好的熒光二抗，室溫避光孵育1 h，PBS 緩沖液洗滌3 次，共15 min。洗滌后DAPI 核染色劑避光孵育10 min，洗滌后加入防熒光淬滅劑，熒光顯微鏡下觀察拍照。

1.3.8 酶聯免疫吸附實驗（ELISA）檢測細胞分泌SFRP1 水平加入標準品或樣品后37 ℃孵育2 h；棄去液體，加生物素標記抗體工作液，37 ℃孵育1 h；洗板后加HRP 標記親和素工作液，37 ℃孵育1 h；洗板后加底物溶液，37 ℃孵育15 min；加終止液，終止反應5 min 內用標儀檢測450 nm 波長處的光密度值。

1.3.9 統計學方法采用SPSS 22.0 軟件進行統計學分析。計量資料經正態性檢驗符合正態分布，以均數±標準差表示，組間比較采用t檢驗；以P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 Western blot 檢測SP 細胞RAB27B 敲除后目的基因蛋白表達情況通過Western blot 實驗發現SP 細胞轉染si?RAB27B 48 h 后，RAB27B 蛋白表達量為SP?NC 組（2.86 ± 0.06）vs.SP?R3 組（1.03 ±0.02）；SFRP1 蛋白表達量為SP?NC 組（1.75 ± 0.06）vs.SP?R3 組（0.91 ± 0.02），差異均具有統計學意義（均P<0.01，圖1）。

圖1 Western blot 檢測目的蛋白表達情況Fig.1 The expression of target protein was detected by Western blot

2.2 qPCR 法檢測SP 細胞RAB27B 敲除前后RAB27B、SFRP1 的表達情況qPCR 法檢測發現SP 細胞中RAB27B 表達量：SP?NC 組（1.0 ± 0.02）vs.SP?R3 組（0.449 3±0.026 4）；SFRP1 表達量：SP?NC 組（1.0 ± 0.02）vs.SP?R3 組（0.390 5±0.027 0）。差異具有統計學意義（均P< 0.01）。結果與West?ern blot 結果相一致。見圖2。

圖2 SP 細胞RAB27B 敲除前后RAB27B、SFRP1 的mRNA表達情況Fig.2 mRNA expression of RAB27B and SFRP1 in SP cells before and after RAB27B deletion

2.3 Transwell 法檢測SP 細胞敲除RAB27B 前后侵襲能力的變化Transwell 實驗檢測敲除宮頸癌SP 細胞RAB27B 后，與NC 組比較，腫瘤細胞穿過小室膜的細胞數目的對比變化（圖3）。結果顯示，SP?NC 組（290 ± 3.215）vs.SP?R3 組（162 ± 1.856），表明RAB27B 敲除后SP 細胞穿過小室膜的數目明顯減少，差異具有統計學意義（t= 70.76，P<0.005）。提示RAB27B 能提高宮頸癌SP 細胞的體外遷移能力，與腫瘤遠處轉移相關。

圖3 敲低RAB27B 對宮頸癌SP 細胞侵襲能力影響Fig.3 Effect of RAB27B knockdown on invasion ability of CERVICAL cancer SP cells

2.4 CCK8 法檢測敲除RAB27B 對宮頸癌SP 細胞生長的影響將si?RNA RAB27B 及NC?RAB27B轉染SP 細胞48 h 后鋪板，在37 ℃、5% CO2條件下分別培養1、2、3、4、5 d后測OD值發現（圖4），SP?NC 組（2.476 ± 0.058）vs.SP?R3 組（1.004 ± 0.050），差異具有統計學意義（t= 25.3，P< 0.005）。表明RAB27B 敲除后SP 細胞增值能力明顯下降。提示RAB27B 可能在促進宮頸癌干細胞增殖方面發揮重要作用。

圖4 敲低RAB27B 對宮頸癌SP 細胞增殖的影響Fig.4 Effect of RAB27B knockdown on proliferation of cervical cancer SP cells

2.5 平板克隆檢測敲除RAB27B 對宮頸癌腫瘤細胞克隆形成能力的影響平板克隆實驗結果顯示，在敲除RAB27B 后，宮頸癌SP 細胞的增殖成球能力降低（圖5），SP?NC 組（21±0.065）vs.SP?R3 組（10 ± 0.023），差異有統計學意義（t= 9.526，P=0.011），RAB27B 敲低組的細胞克隆數明顯減少，細胞成球克隆能力明顯下降。即RAB27B 可以促進宮頸癌SP 細胞形成更多細胞集落，在宮頸癌干細胞轉移復發及放化療抵抗方面可能發揮重要作用。

圖5 敲低RAB27B 對宮頸癌SP 細胞平板克隆形成能力的影響Fig.5 Effect of RAB27B knockdown on plate clon?forming ability of cervical cancer SP cells

2.6 RAB27B、SFRP1 細胞熒光定位通過免疫熒光實驗發現RAB27B 在SP 細胞中主要定位于細胞核中，在細胞質中也有少量表達。SFRP1在SP細胞中也主要定位于細胞核（圖6）。

2.7 ELISA 酶聯免疫吸附實驗檢測RAB27B 敲除后SFRP1的外分泌變化通過酶聯免疫吸附實驗發現，RAB27B 敲除后的SP 細胞分泌SFRP1 的能力下降。SP?NC組SFRP1外分泌值為（19.38±0.43）ng/mLvs.SP?si?R3 組（10.66± 0.25）ng/mL，P= 0.008。見圖6。

圖6 RAB27B、SFRP1 細胞熒光定位Fig.6 Fluorescence localization of RAB27B、SFRP1 cells

3 討論

宮頸癌作為我國女性常見癌癥之一，具有較高的復發率及死亡率［1］。隨著宮頸癌篩查的普及，其發生率有所降低，但對于晚期、復發及耐藥患者仍無十分有效的治療手段。越來越多的研究表明，腫瘤的復發、耐藥與腫瘤干細胞高度相關［2］，且研究發現RAB 蛋白可以介導乳腺癌干細胞［18］、膠質瘤干細胞［19］、肺癌干細胞［20］等干性維持，與結腸癌等耐藥亦息息相關［17］。

前期前期單細胞轉錄組學測序研究發現，在宮頸癌SP 細胞中高表達而在NSP 細胞中低表達，表明RAB27B 在宮頸癌干細胞中高表達。且通過查閱TCGA 數據庫可知，RAB27B 在正常宮頸組織中低表達而在宮頸癌組織中高表達，表明RAB27B在宮頸癌中發揮促癌基因作用，可以促進宮頸癌的發生發展。查閱文獻發現RAB27B 與多種癌癥干細胞的干性維持密切相關［18-20］，故本文作者推測RAB27B 在宮頸癌干細胞的發生機制中起著重要作用。

圖7 ELISA 法檢測RAB27B 敲除前后SFRP1 分泌情況變化Fig.7 Changes of SFRP1 secretion before and after RAB27B knockout were detected by ELISA

因為目前對于宮頸癌干細胞并沒有標準的分離鑒定方法，故本文作者選用流式分選出的具有干性特征的SP細胞作為研究對象［3］。通過RAB27B 敲低片段及對照片段轉染48 h 后進行體外相關功能實驗發現，RAB27B 敲低后的宮頸癌SP 細胞增殖、侵襲遷移及平板克隆能力明顯降低，進一步發現RAB27B 在宮頸癌SP 細胞中具有重要的作用，可以促進宮頸癌干細胞干性能力的增強。在肺癌干細胞中，RAB37 與SFRP1 共定位于相同囊泡中，且RAB37 以GTP 核苷酸依賴方式介導SFRP1 的轉運和分泌，故在宮頸癌SP 細胞中，RAB27B 也可能通過調控囊泡的分泌而調節SFRP1 的分泌。免疫熒光實驗發現，RAB27B 與SFRP1 在SP 細胞中都主要定位于細胞核，且TCGA 數據庫顯示，RAB27B與SFRP1 在宮頸癌中表達具有一定相關性，結合RAB27B 敲低前后SFRP1 蛋白含量及mRNA 含量變化可知，RAB27B 對于SFRP1 的表達具有一定的調節作用。文獻表明，SFRP1 通過WNT、EMT 等多條信號通路對宮頸癌的發生發展起到一定的調節作用［21-22］。故RAB27B 可能通過調節SFRP1 的表達而對宮頸癌干細胞干性的維持起到調控作用。

目前，本文發現RAB27B 對于宮頸癌干細胞的增殖、侵襲具有一定的調節作用，且文獻表明，RAB 蛋白與多種癌癥的干性維持及耐藥密切相關［17-19］，故RAB27B 可能成為宮頸癌患者預后標志物及新的治療靶點，可以針對RAB27B 設計靶向藥物或者RAB27B 高效安全的抑制劑來抑制宮頸癌干細胞的存活，從而延長晚期復發患者的生存時間。本文僅在體外細胞水平驗證RAB27B 的作用，并沒有在體內小鼠身上進一步驗證。眾所周知，動物體內微環境是一個復雜動態平衡的過程，由多種機制共同調控［4］，是否RAB27B 在動物體內發揮同樣的功效有待研究，后續可以設計皮下成瘤、肝轉移及類器官模型加以驗證。此外，下一步需要過表達及敲低SFRP1 觀察宮頸癌干細胞的干性及RAB27B 的表達水平變化情況，進一步證實RAB27B 與SFRP1 在宮頸癌干細胞中相關關系。