玉竹醇提取物B調控免疫代謝抗結直腸癌的藥理機制研究

趙守彰 馬強 權冬梅

1遼寧醫藥職業學院（沈陽 110101）；2沈陽市第六人民醫院中西醫結合肝病科（沈陽 110006）

有研究提示，結直腸癌（colorectal cancer，CRC）與各種原因引起的長期炎癥以及自身免疫異常之間關系密切［1-2］。手術以及化療依舊是CRC 治療的主流，但傳統西醫治療存在手術切除不完全以及骨髓抑制等問題［3］。尋求更為安全有效的治療手段，是CRC 研究的新重點。玉竹是我國中醫常用中藥，其根莖內含有黃酮、生物堿、強心苷等多類物質，具有生津止渴、潤燥除煩等功效。現代藥理學研究發現，玉竹醇提取物B 具有抑癌功效，但其中的具體作用機制尚未明確［4-5］。為研究玉竹醇提取物B 是否能夠通過調控免疫代謝抑制CRC，發揮抗癌功效，我院開展如下研究。

1 材料與方法

1.1 實驗動物實驗動物為雄性BALB/CA?nu 裸小鼠，共25 只，SPF 級，5 周周齡，體質量（20±2）g，購自四川匯宇海玥醫藥。許可證號：SYXK（川）2021?234。小鼠所處環境符合相關標準的嚴格受控環境，溫度（23 ± 1）℃，濕度（55 ± 5）%，光照時間為每日上午8：00～20：00，12 h 循環，小鼠標準飼料自由飲水，本研究經動物實驗倫理批準（批準編號：2019JX0774）。

1.2 試驗試劑及器材（1）試驗試劑包括：小鼠IL?2 ELISA試劑盒、小鼠IL?12 ELISA試劑盒、TNF?α ELISA 試劑盒。紅細胞裂解液購自Solarbio 公司。（2）試驗儀器包括：全自動血細胞分析儀（型號HEMAVET950FS，美國）、組織勻漿器（S?18K，普萊特科技儀器）、高速離心機（型號：MiniSpin，德國Eppendorf）、流式細胞儀（型號：CytoFLEX，Beck?man Coulter）。（3）抗體：熒光抗體FITC?CD3e Mono?clonal Antibody（145?2C11）、APC?CD28 Monoclonal Antibody（37.51）。均購自Thermo Fisher Scientific。小鼠淋巴瘤細胞（YAC?1）購自美國模式培養物集存庫（ATCC）。（4）玉竹醇提取物B 由沈陽藥科大學免疫實驗室提取，純度≥95%，采用水醇法提取，取洗凈切碎玉竹根莖，經30%乙醇浸提，取浸漬液，旋轉蒸發儀蒸發回收乙醇，得黃棕色沉淀烤箱干燥后，定量，用雙蒸水配成不同濃度，高壓滅菌后備用。

1.3 動物模型建立及治療方案（1）根據文獻［6］中相關步驟建立CRC 小鼠模型：以脂質體2000 介導的chicken β?actin?GFP?neo 和chicken β?actinD?sRed?neo 轉染人結腸癌細胞HCT?116，梯度濃度G418 篩選獲得穩定表達紅色和綠色熒光蛋白的細胞克隆并擴大培養，BALB/CA?nu 裸鼠皮下接種1 106 個發光細胞使其成瘤。（2）分組及給藥方法：將25 只實驗小鼠分為空白對照組、CRC 模型組及CRC+不同濃度玉竹醇提取物B 處理組（低劑量組、中劑量組、高劑量組），CRC+不同濃度玉竹醇提取物B 處理組小鼠分別給予1 g/kg、2 g/kg、3 g/kg玉竹醇提取物B 腹腔注射，空白對照組及CRC模型組給予等體積生理鹽水腹腔注射，連續給藥8 周。

1.4 血液及組織樣本采集末次給藥30 min后，抽取小鼠全血3 mL，使用1.5 mL EP 管采集全血，離心機4 000 rpm，離心10 min，微量移液器收集血清，置于-80 ℃冰箱內保存。血液采集完畢后，處死小鼠，取出其脾臟、心臟、腎臟及結直腸癌部位。計算臟器指數：臟器指數（mg/g）=臟器重量/小鼠總體質量。

1.5 外周血NK 細胞殺傷活性檢測NK 細胞殺傷活性測定：末次給藥30 min 后處死小鼠，取小鼠脾臟，配置LDH 基質液，復活YAC?1 靶細胞，制備脾細胞懸液，并將其濃度調整為1 × 107個/mL，臺盼藍細胞計數試驗確保脾細胞懸液中細胞存活率＞95%，將100 μL 靶細胞與100 μL 效應細胞接種于U 型96 孔培養板，自然釋放孔、最大釋放孔及實驗孔內分別加入：100 μL YAC?1+100 μL RPMI?1640，100 μL YAC?1+100 μL 1%NP?40，100 μL YAC?1+100 μL 脾細胞，孔板上每個孔都做3 個復孔，37℃、5%CO2環境下孵育2 h，將96 孔板離心（1 000 rpm，2 min）吸取96 孔板每孔100 μL 上清液平行放置于一個新的平底96 孔培養板，后置于飽和水汽培養箱中孵育10 min，向96 孔板中每孔加入100 μL LDH 基底液，將液體充分混勻靜置于室溫中避光15 min。使用多功能酶標儀讀取570 nm處OD值，NK 細胞殺傷活性（%）=（實驗孔OD值-自然釋放孔OD值）/（最大釋放孔OD值?自然釋放孔OD值）×100%。

1.6 小鼠結直腸癌形成情況觀察小鼠安樂死后，使用解剖剪剪開小鼠腹腔，找到整段腸道，生理鹽水沖洗結直腸，每組小鼠選擇三條完整的結直腸，延盲腸末端對其平行，放置在紙板上，拍照，對結直腸癌形成個數進行計數。

1.7 檢測血清免疫相關指標水平采用ELISA 法檢測血清白細胞介素?2（interleukin?2，IL?2）、白細胞介素?12（interleukin?12，IL?12）、腫瘤壞死因子?α（tumor necrosis factor?α，TNF?α）水平。嚴格按照試劑盒相關步驟進行操作。

1.8 統計學方法采用SPSS 19.0 統計軟件處理數據。計量資料以（）表示，多組間比較行單方差分析，兩兩比較行LSD?t檢驗；計數資料用例（%）表示，組間比較行χ2檢驗，以P< 0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組小鼠外周血NK細胞殺傷活性比較CRC模型組小鼠血液中NK 細胞對靶細胞的殺傷活性明顯低于空白對照組，而不同濃度玉竹醇提取物組小鼠NK 細胞對靶細胞的殺傷活性較模型組升高，其中中劑量組NK 細胞殺傷活性高于低劑量組，高劑量組NK 細胞殺傷活性高于中劑量組。見表1、圖1。

表1 各組小鼠外周血NK 細胞殺傷活性比較Tab.1 Comparison of peripheral blood NK cell killing activity among groups±s

表1 各組小鼠外周血NK 細胞殺傷活性比較Tab.1 Comparison of peripheral blood NK cell killing activity among groups±s

注：與空白對照組比較，*P<0.05，與模型組比較，#P<0.05，與玉竹醇低劑量組比較，aP<0.05，與玉竹醇中劑量組比較，bP<0.05

組別空白對照組模型組玉竹醇提取物低劑量組玉竹醇提取物中劑量組玉竹醇提取物高劑量組F 值P 值NK 細胞殺傷活性（%）50.16±13.25 32.17±6.52*35.96±5.41#37.51±7.03#a 42.25±6.65#ab 3.507 0.025

圖1 各組小鼠外周血NK 細胞殺傷活性比較Fig.1 Comparison of peripheral blood NK cell killing activity among groups

2.2 各組小鼠外周血炎癥因子水平比較與空白對照組相比，模型組小鼠外周血IL?2、IL?12 及TNF?α水平均下降，差異具有統計學意義（P< 0.05），而與模型組小鼠相比，不同濃度玉竹醇提取物組小鼠血清IL?2、IL?12 以及TNF?α 水平均上升，其中中劑量組血清IL?2、IL?12以及TNF?α水平水平高于低劑量組，高劑量組血清IL?2、IL?12 以及TNF?α 水平高于中劑量組，差異均具有統計學意義（P< 0.05）。見表2。

表2 各組小鼠外周血炎癥因子水平比較Tab.2 Comparison of peripheral blood inflammation factors among groups±s

表2 各組小鼠外周血炎癥因子水平比較Tab.2 Comparison of peripheral blood inflammation factors among groups±s

注：與空白對照組比較，*P<0.05，與模型組比較，#P<0.05，與玉竹醇低劑量組比較，aP<0.05，與玉竹醇中劑量組比較，bP<0.05

組別空白對照組模型組玉竹醇提取物低劑量組玉竹醇提取物中劑量組玉竹醇提取物高劑量組F值P值IL?2（pg/mL）623.15±61.46 317.59±60.36*413.15±53.69#469.99±67.15#a 546.58±66.87#ab 18.051<0.001 IL?12（pg/mL）1.91±0.21 1.26±0.24*1.45±0.25#1.59±0.34#a 1.85±0.29#ab 5.085<0.001 TNF?α（pg/mL）634.15±73.15 326.46±66.84*376.48±70.55#426.58±63.87#a 541.67±75.74#ab 15.978<0.001

2.3 各組小鼠臟器指數比較模型組與玉竹醇提取物組心臟及肝臟等指數比較，差異均無統計學意義（P> 0.05），但不同濃度玉竹醇提取物組脾臟指數及胸腺指數均較模型組高，其中中劑量組脾臟及胸腺指數高于低劑量組，高劑量組脾臟及胸腺指數高于中劑量組，差異均具有統計學意義（P<0.05）。

2.4 各組小鼠結直腸腫瘤形成情況比較解剖發現，模型組小鼠結直腸中可見腫瘤與其他異常增生，而經不同濃度玉竹醇提取物處理后的CRC模型小鼠結直腸中腫瘤與其他異常增生數目明顯減少［（8.83±0.71）vs.（4.68±0.46）vs.（3.41±0.78）vs.（2.13±0.53），F=65.642，P<0.001］。見圖2。

表3 各組小鼠臟器指數比較Tab.3 Comparison of organ index among groups±s

表3 各組小鼠臟器指數比較Tab.3 Comparison of organ index among groups±s

注：與空白對照組比較，*P<0.05，與模型組比較，#P<0.05，與玉竹醇低劑量組比較，aP<0.05，與玉竹醇中劑量組比較，bP<0.05

組別空白對照組模型組玉竹醇提取物低劑量組玉竹醇提取物中劑量組玉竹醇提取物高劑量組F 值P 值心臟指數9.39±1.13 9.41±1.02 9.36±1.23 9.37±1.21 9.43±1.18 0.003 1.000肝臟指數50.13±2.34 48.79±3.33 49.59±2.79 50.02±3.51 48.66±2.83 0.261 0.899脾臟指數13.69±1.69 5.14±1.33*7.43±1.52 9.41±1.37 11.85±2.03 22.414<0.001肺臟指數6.76±1.47 6.69±1.53 6.94±1.61 6.84±1.45 6.91±1.55 0.021 0.999腎臟指數12.68±1.43 13.03±1.39 12.95±1.37 12.87±1.65 12.91±1.74 0.032 0.998胸腺指數1.65±0.24 0.76±0.21*1.33±0.27#1.47±0.19 1.62±0.17 13.682<0.001

圖2 各組小鼠結直腸腫瘤形成情況比較Tab.2 Comparison of colorectal tumor formation in mice of each group

3 討論

CRC 是臨床常見的消化系統惡性腫瘤，具有發病率高的特點。手術治療是CRC 的首選，但對于部分晚期CRC 患者，術后依舊存在腫瘤轉移及復發風險，而聯合化療可能導致骨髓抑制問題。中藥治療安全性高，在輔助多種惡性腫瘤的治療中均具有良好的療效［7-9］。

玉竹醇提取物B 提取自傳統中草藥玉竹，有研究表示［10-11］，玉竹醇提取物B 能抑制腫瘤形成，延長荷瘤小鼠生存時間。本研究發現，經與玉竹醇提取物B 干預后，CRC 小鼠結直腸處腫瘤數目及異常增生均較未經治療的模型組明顯減少，說明玉竹醇提取物B 在CRC 中也具有抗癌功效，與上述研究結果一致。但關于玉竹醇提取物B 在抗癌中的具體作用機制尚不明確。

自身免疫異常是CRC 發病及發展的重要原因，同時，免疫功能調節也是機體抗癌的重要組成。免疫功能調節能激活機體免疫細胞活力，殺傷癌細胞，實現免疫介導的癌細胞清除［12-14］。為探討玉竹醇提取物B 是否能夠通過調控免疫功能，在CRC 中發揮作用，本研究檢測CRC 玉竹醇提取物B 干預的CRC 小鼠免疫相關指標。NK 細胞是免疫系統的重要作用細胞，其能有效識別、殺死惡性細胞，并維持機體免疫穩態［15-17］。本研究結果提示，玉竹醇提取物組小鼠血液中NK 細胞對靶細胞的殺傷活性明顯高于模型組，說明玉竹醇提取物B 能有效提高結直腸癌大鼠免疫功能。

ILs 及TNFs 都具有免疫調控和抗腫瘤活性，免疫相關細胞因子具備抗腫瘤活性作用［18-20］。其中IL?2 不僅能促進NK、T 細胞以及B 細胞增殖，還能增強T 細胞及NK 細胞對腫瘤的殺傷作用，進而增強機體對腫瘤的特異性免疫作用。IL?12 可提高NK 細胞活性，促進TNF?α 分泌，進而強化腫瘤細胞殺傷能力［21-22］。我院研究發現，與CRC 模型小鼠相比，經玉竹醇提取物B 干預的CRC 小鼠血清IL?2、IL?12以及TNF?α水平均明顯上升，脾臟及胸腺是機體免疫調節的重要器官，本研究發現，與空白健康小鼠相比，CRC 模型小鼠脾臟及胸腺指數均下降，說明CRC 存在明顯的免疫紊亂狀況［23-25］。而經玉竹醇提取物B 干預后，CRC 小鼠以上兩脾臟指數均較模型組上升。解剖發現，模型組小鼠結直腸中可見腫瘤與其他異常增生，而經不同濃度玉竹醇提取物處理后的CRC 模型小鼠結直腸中腫瘤與其他異常增生數目明顯減少提示玉竹醇提取物B 可通過調節免疫系統功達到抑制結直腸癌效果。

綜上所述，玉竹醇提取物B 可能通過調節免疫代謝減少CRC 結直腸腫瘤數目及異常增生，發揮抗癌作用。