過氧化酶與葡萄糖氧化酶復合交聯(lián)酶聚集體的制備與應用

李彥潔，高靜，姜艷軍，周麗亞

(河北工業(yè)大學 化工學院，天津，300000)

惰性碳氫鍵的選擇性單加氧反應是有機合成中具有探索意義的一類化學反應，目前主要采用化學法和酶法催化，化學催化法往往反應條件苛刻，而酶催化法相對溫和，且具有很高的區(qū)域和對映選擇性[1]。來自茶樹菇(Agrocybeaegerita)的非特異性過氧化酶(unspecific peroxygenase，Aae UPO，EC 1.11.2.1)僅需H2O2為共底物即可進行復雜的單加氧反應[2]，在催化乙苯反應時，(R)-苯乙醇產(chǎn)率可達到99.9%，對映體過量(enantiomeric excess, ee)值大于99.9%[2]。但是，非特異性過氧化酶作為一種血紅素依賴型酶，在高濃度H2O2下容易失活[3]。酶催化原位產(chǎn)生H2O2可持續(xù)穩(wěn)定地為AaeUPO提供較低濃度的H2O2，且過程溫和高效[4]，是一種避免外加高濃度H2O2的有效途徑之一。

葡萄糖氧化酶(glucose oxidase，GOx)是原位產(chǎn)生H2O2最常用的酶源。GOx氧化葡萄糖的同時將O2還原為H2O2，僅產(chǎn)生葡萄糖酸內(nèi)酯一種無毒無害的副產(chǎn)物。此外，與GOx結合的酶級聯(lián)系統(tǒng)與單次添加H2O2相比，更有助于酶穩(wěn)定性的提高。在GOx與氯過氧化物酶(chloroperoxidase,CPO)結合的酶級聯(lián)系統(tǒng)中，總的反應速率由H2O2進入CPO活性口袋的速度決定，催化茴香硫醚的產(chǎn)率最高可達100%[5]。YANG等[6]通過制備復合交聯(lián)酶聚集體的方式對GOx和辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)進行共固定，在此級聯(lián)反應中，沒有H2O2積累，說明GOx產(chǎn)生的H2O2被HRP有效利用，同時雙酶復合交聯(lián)酶聚集體(combi-CLEAs)獲得了更高的穩(wěn)定性。

本研究采用交聯(lián)酶聚集體方法共固定AaeUPO與GOx，通過優(yōu)化AaeUPO與GOx的酶活力比例、沉淀劑與酶液的體積比、交聯(lián)劑的體積分數(shù)以及牛血清白蛋白(bovine serum albumin, BSA)的質(zhì)量濃度，以期得到高酶活回收率的combi-CLEAs。在乙苯惰性C—C鍵上加入氧原子需要約400 kJ/mol的能量，而生物催化法可以高效環(huán)保的實現(xiàn)這一過程，因此以乙苯為模型底物，將combi-CLEAs用于催化乙苯生成(R)-苯乙醇，考察反應液pH、反應溫度和葡萄糖濃度對乙苯轉化率的影響，并以不同底物對combi-CLEAs的催化性能進行驗證。該研究制備AaeUPO與GOx的combi-CLEAs，有助于2種酶結合得更緊密，提高催化效率[7-8]。

1 材料與方法

1.1 材料

AaeUPO菌株，實驗室構建的基因工程菌P.pastoris/pPIC9k/PaDa-I；GOx(231 U/mg)，上海源葉生物科技有限公司；異丙醇、葡聚糖、高碘酸鈉、BSA、葡萄糖、ABTS、酵母粉、蛋白胨，天津鼎國生物技術有限責任公司；乙苯、乙酸乙酯、乙腈，凱瑪特(天津)化工科技有限公司；H2O2(AR)，天津市江天化工技術有限公司；其他試劑均為市售分析純。

BMGY培養(yǎng)基：1%酵母粉(質(zhì)量分數(shù)，下同)、2%蛋白胨、1.34%YNB、4×10-5%生物素、1%甘油、100 mmol/L磷酸鉀緩沖液(pH 6.0)；BMMY培養(yǎng)基：1%酵母粉、2%蛋白胨、1.34%YNB、4×10-5%生物素、1%甲醇、100 mmol/L的磷酸鉀緩沖液(pH 6.0)。其中YNB、生物素和甲醇不能高溫滅菌，用0.22 μm的水系濾膜除菌，其他培養(yǎng)基在121 ℃下高溫滅菌20 min。

1.2 實驗方法

1.2.1AaeUPO的制備

在BMGY培養(yǎng)基中，以1%的接種量將AaeUPO甘油菌進行活化，在30 ℃、220 r/min條件下培養(yǎng)16～18 h，待OD600≥2后，8 000 r/min離心10 min，收集菌體。將菌體加入到BMMY誘導培養(yǎng)基中復溶，在30 ℃、220 r/min條件下進行誘導表達，隨后每隔24 h加入1次體積分數(shù)1%甲醇，連續(xù)誘導5 d。離心分離發(fā)酵液(8 000 r/min，10 min)，收集上清液，得到粗酶液。經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳測定，AaeUPO為46 kDa的胞外酶(圖1)，對其酶活性進行測定，AaeUPO的比酶活力為130 U/mg。

M-Marker；1-AaeUPO圖1 AaeUPO粗酶液的SDS-PAGEFig.1 SDS-PAGE of AaeUPO

1.2.2 葡聚糖醛的制備

將1.65 g葡聚糖和3.85 g高碘酸鈉溶于50 mL蒸餾水中，室溫下攪拌反應90 min。倒入透析袋中，透析24 h，中途不斷更換超純水以去除殘余的高碘酸鈉，冷凍干燥后備用。

1.2.3 Combi-CLEAs的制備

制備過程如圖2所示。GOx(30 U/mL，pH 7.0)與AaeUPO(pH 7.0)按比例混合至2 mL，加入一定量的BSA和沉淀劑，25 ℃下磁力攪拌30 min。隨后加入一定體積分數(shù)的交聯(lián)劑，10 ℃下交聯(lián)3 h。8 000 r/min下離心10 min，棄去上清液，所得沉淀經(jīng)磷酸鹽緩沖液(100 mmol/L，pH 7.0)重懸洗滌離心3次，即得combi-CLEAs。

分別考察GOx與AaeUPO酶活力比、沉淀劑與酶液的體積比、交聯(lián)劑體積分數(shù)和BSA質(zhì)量濃度對combi-CLEAs酶活回收率的影響。

圖2 Combi-CLEAs的制備過程Fig.2 Preparation process of combi-CLEAs

1.2.4 酶活力和蛋白質(zhì)濃度測定

游離AaeUPO和combi-CLEAs的酶活性測定均采用ABTS顯色法[9]。在1 mL反應體系中加入4 mmol/L葡萄糖、0.3 mmol/L ABTS、適量的combi-CLEAs和檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液(100 mmol/L，pH 5.0)，30 ℃下反應5 min，在波長418 nm下測得反應液的吸光值。活力單位(U)定義：在30 ℃、pH 5.0條件下，在1 min內(nèi)生成1 μmol ABTS自由基所需要的酶量為1 U。比酶活、相對酶活力和酶活回收率的計算如公式(1)～(3)所示：

(1)

(2)

(3)

蛋白質(zhì)濃度采用考馬斯亮藍法測定。

2 結果與分析

2.1 Combi-CLEAs制備條件優(yōu)化

H2O2是AaeUPO的共底物，較高濃度的H2O2會導致AaeUPO失活，為使中間產(chǎn)物H2O2的產(chǎn)生和消耗達到平衡，需要考察雙酶酶活力比對combi-CLEAs酶活力的影響[10-11]。如圖3-a所示，當GOx與AaeUPO的酶活力比為6∶1時，酶活回收率最高。其原因是當GOx與AaeUPO酶活力比較低時，GOx催化葡萄糖氧化產(chǎn)生的H2O2較少，導致AaeUPO催化動力不足。而當GOx與AaeUPO酶活力比過高時，GOx為AaeUPO提供的H2O2濃度過高，造成AaeUPO血紅素中心的穩(wěn)定性變差甚至失活。當GOx與AaeUPO的酶活力比為6∶1時，GOx為AaeUPO提供的H2O2處在一個供應和消耗平衡的狀態(tài)，可使combi-CLEAs持續(xù)高效地進行催化。

制備combi-CLEAs的過程中選用了沉淀效果較好的異丙醇，隨后考察了異丙醇與酶液的體積比對酶活力回收率的影響。如圖3-b所示，當異丙醇與酶液體積比為1∶1時，酶活力回收率較低，這是因為沉淀劑過少時無法破壞酶的水化層，沉淀不完全，部分酶無法交聯(lián)[12]。當異丙醇與酶液體積比為2∶1時，combi-CLEAs的酶活力回收率達到最大，為63.68%，比酶活力為40.17 U/mg。異丙醇繼續(xù)增加，過多的異丙醇會爭奪酶分子表面的水化層甚至改變它的結構與構象，從而導致酶變性失活。

制備交聯(lián)酶聚集體時，一般是酶分子表面上賴氨酸的氨基與交聯(lián)劑的醛基以非共價鍵的方式結合，但如果交聯(lián)時涉及到酶活性中心的氨基，則會對酶活性造成較大影響。因此，本實驗中選用了分子質(zhì)量較大的葡聚糖醛(200 kDa)做交聯(lián)劑，防止交聯(lián)劑穿透酶的活性位點與催化所必需氨基酸殘基反應[13]。如圖3-c所示，當葡聚糖醛體積分數(shù)過低時，無法使酶充分交聯(lián)，而體積分數(shù)過高，會使酶分子過度交聯(lián)，柔韌性變差[14]，酶活力回收率降低。葡聚糖醛的體積分數(shù)為15%時，combi-CLEAs的酶活力回收率最高，為82.55%，此時的比酶活力為59.03 U/mg。為解決酶因賴氨酸殘基較少，無法充分交聯(lián)的問題，在交聯(lián)過程中加入富含氨基的BSA，BSA可使酶分子被充分交聯(lián)，減少酶分子的泄露，使combi-CLEAs的機械性能更加穩(wěn)定[15-16]。如圖3-d所示，隨著BSA質(zhì)量濃度的增加，酶活力回收率提高。但當BSA質(zhì)量濃度過大時，部分交聯(lián)劑用于BSA之間的交聯(lián)，使酶分子無法充分交聯(lián)，所以酶活力回收率降低[17]。當BSA質(zhì)量濃度為40 μg/mL時，combi-CLEAs的酶活回收率最高，為87.43%，比酶活力為63.12 U/mg。

綜上，制備combi-CLEAs時，GOx與AaeUPO酶活力比為6∶1、異丙醇與酶液的體積比為2∶1、200 kDa葡聚糖醛體積分數(shù)為15%，且加入40 μg/mL的BSA為保護劑時，combi-CLEAs的酶活力回收率為87.43%，比酶活力為63.12 U/mg。

a-酶活力比；b-異丙醇與酶液體積比；c-200 kDa葡聚糖醛的體積分數(shù)；d-BSA的質(zhì)量濃度圖3 Combi-CLEAs制備條件的優(yōu)化Fig.3 Optimization of preparation conditions of combi-CLEAs

2.2 Combi-CLEAs催化乙苯的羥基化反應

將制備的combi-CLEAs用于催化乙苯生成光學純(R)-苯乙醇，考察反應液pH、反應溫度、葡萄糖濃度對乙苯轉化率的影響。

2.2.1 pH和溫度對反應的影響

酶的催化效率受多種環(huán)境因素影響，其中pH值的變化可改變酶分子活性部位和整個表面的電荷分布，進而導致乙苯轉化率的改變[18]，而溫度的變化則影響酶分子的天然結構，導致其催化活性改變，最終影響乙苯的轉化率[19]。由實驗結果可知，combi-CLEAs催化乙苯的最適pH為7.0，最適溫度為30 ℃。

2.2.2 葡萄糖濃度對反應的影響

GOx以葡萄糖為底物生成H2O2與葡萄糖酸內(nèi)酯，AaeUPO利用產(chǎn)生的H2O2為共底物催化乙苯的羥基化反應。葡萄糖濃度直接影響GOx生成H2O2的濃度與速率，間接影響了AaeUPO催化乙苯的轉化，因此需要對葡萄糖濃度進行優(yōu)化。

從圖4-a可以看出，葡萄糖初始濃度為2 mmol/L，H2O2生成速率較快，此濃度下combi-CLEAs在20 min時對乙苯的轉化率為67.0%。隨著時間的延長，乙苯的轉化率最高可達91.4%，這說明在2 mmol/L葡萄糖濃度下，GOx可以較為迅速地為AaeUPO提供H2O2，但累積的H2O2不足以完全催化乙苯的反應。由圖4-b、圖4-c可以看出，在葡萄糖初始濃度為4和6 mmol/L時，乙苯最終的轉化率均略高于2 mmol/L葡萄糖濃度，說明GOx能為AaeUPO提供較為充足的H2O2。反應20 min時，4 mmol/L葡萄糖濃度下乙苯的轉化率要高于6 mmol/L葡萄糖濃度，這可能是由于較高濃度的H2O2對GOx造成了一定程度的產(chǎn)物抑制[20]。由圖4-d可以看到，在8 mmol/L的葡萄糖濃度下，在反應20 min時，由于受到明顯的產(chǎn)物抑制，GOx無法快速提供足夠的H2O2，使得此時combi-CLEAs對乙苯的轉化率僅為18.3%。而在3 h后乙苯的轉化率為89.2%，較低的乙苯轉化率可能是由于產(chǎn)生的H2O2濃度較高，造成了部分combi-CLEAs的不穩(wěn)定[21]所致。由圖4可以得出在6 mmol/L葡萄糖濃度下，可以得到99.9%的乙苯轉化率，且(R)-苯乙醇ee值大于99.9%。

2.2.3 Combi-CLEAs重復使用性

實現(xiàn)生物催化劑的重復使用是固定化酶的重要目標之一。Combi-CLEAs操作穩(wěn)定性如圖5-a所示，在重復使用過程中，乙苯轉化率逐次降低，重復使用第8次時乙苯轉化率降為67.2%。經(jīng)圖5-b可知，造成轉化率降低的原因是由于緩沖液對combi-CLEAs的不斷沖洗使部分酶脫落，另外重復操作會導致蛋白構象發(fā)生變化，使活性部位發(fā)生扭曲，導致酶分子自身變性[22]。

2.3 Combi-CLEAs催化其他底物的羥基化反應

Combi-CLEAs通過無載體固定化的方式將GOx與AaeUPO進行緊密結合，使GOx原位穩(wěn)定的為AaeUPO提供催化所需的H2O2。相較于外加H2O2的方式，combi-CLEAs在催化不同底物進行單加氧反應時更加穩(wěn)定高效。由表1可以看出，combi-CLEAs對不同底物的轉化率均高于AaeUPO-CLEAs，說明其在實際應用中還有很大的空間。

圖5 Combi-CLEAs操作穩(wěn)定性Fig.5 Operation stability of combi-CLEAs

3 結論

AaeUPO廣泛用于單加氧反應中，該類反應均以H2O2為共底物，鑒于GOx可原位制備H2O2，本文構建了GOx與AaeUPO復合交聯(lián)酶聚集體級聯(lián)催化系統(tǒng)。論文考察了制備條件對combi-CLEAs的活性的影響，在GOx與AaeUPO的酶活力比為為6∶1、異丙醇與酶液體積比為2∶1、200 kDa的葡聚糖醛體積分數(shù)為15%，加入BSA后進行交聯(lián)，在該條件下獲得了結構緊密、機械穩(wěn)定的combi-CLEAs，其比酶活力為63.12 U/mg。通過設計級聯(lián)系統(tǒng)為AaeUPO提供H2O2，酶的穩(wěn)定性大大提高，將combi-CLEAs用于催化乙苯羥基化生成(R)-苯乙醇的反應中，在優(yōu)化的pH、反應溫度和葡萄糖濃度條件下，乙苯的轉化率高達99.9%，產(chǎn)物(R)-苯乙醇的ee值>99.9%，重復使用8次后，仍保留67.2%的乙苯轉化率。并且將combi-CLEAs應用不同底物的羥基化時，其性能均優(yōu)于外加H2O2的AaeUPO-CLEAs。由于該固定化方法對酶要求較低，適合于多酶的固定化，且GOx與AaeUPO構成的固定化級聯(lián)系統(tǒng)穩(wěn)定好、催化效率高且易于制備，因此在大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)方面具有很好的應用前景。

表1 AaeUPO-CLEAs與combi-CLEAs用于催化不同底物的羥基化Table 1 AaeUPO-CLEAs and combi-CLEAs are used to catalyze the hydroxylation of different substrates