以甘油為碳源生產低分子質量β-1,3-葡聚糖的發酵工藝

李敏，朱莉，詹曉北*

1(教育部糖化學與生物技術重點實驗室，江南大學 生物工程學院，江蘇 無錫，214122) 2(無錫格萊克斯生物科技有限公司，江蘇 無錫，214125)

低分子質量β-1,3-葡聚糖是一種葡萄糖以β-1,3-糖苷鍵連接而成的同型寡糖[1]，相比于高聚合度的β-1,3-葡聚糖，低分子質量β-1,3-葡聚糖水溶性較好，具有抗菌、抗腫瘤、免疫調節以及調節血糖血脂等生物活性和醫藥活性[2-4]，且其生物活性隨著分子質量的降低而增高[5]。低分子質量β-1,3-葡聚糖多樣的生物活性使其市場需求逐漸增加，如何低成本、綠色環保地生產低分子質量β-1,3-葡聚糖已經成為研究熱點。

目前，制備低分子質量β-1,3-葡聚糖主要通過酶法降解[6-7]、物理降解[8]以及化學降解[9-10]等方法，但這些方法存在工藝復雜、化學廢液排放以及成本較高等問題[11-13]，限制了其大規模工業化生產。近些年來，已有利用微生物共培養發酵獲得低分子質量β-1,3-葡聚糖的方法[14-15]，但共培養技術工藝較為困難，菌體培養流程較為復雜。王冰等[16]對產熱凝膠菌種Agrobacteriumsp.ATCC 31749進行甘油適應性馴化，得到1株可產低分子質量β-1,3-葡聚糖的菌株Agrobacteriumsp.WS-8E3T，但產量僅有1.648 g/L。

發酵過程中的碳源、氮源、pH等因素都會對產量造成影響，本文利用該菌株，在搖瓶水平進行發酵條件的優化，并進行7 L發酵罐的驗證實驗，為進一步大規模生產低分子質量β-1,3-葡聚糖提供理論基礎。

1 實驗材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗菌種

Agrobacteriumsp.WS-8E3T，保藏于江南大學糖生物制造與生物反應器研究室。

1.1.2 培養基

平板培養基(g/L)：甘油100.0，酵母粉10.0，魚粉蛋白胨2.0，胰蛋白胨2.0，瓊脂粉20.0，pH 7.0，121 ℃滅菌20 min。

種子培養基(g/L)：甘油40.0，酵母粉6.0，KH2PO41.5，MgSO40.5，pH 7.0，121 ℃滅菌20 min。

基礎搖瓶發酵培養基(g/L)：甘油100.0，酵母粉6.0，KH2PO43.0，MgSO41.5，(NH4)2SO42.0，pH 7.0，121 ℃滅菌20 min。

所有優化實驗均在此基礎培養基的基礎上進行，7 L發酵罐培養基為優化后的搖瓶發酵培養基。

1.2 主要試劑

甘油、魚粉蛋白胨、胰蛋白胨、酵母粉、無水乙醇、三氯甲烷、正丁醇、三氟乙酸、甲醇，國藥集團化學試劑有限公司；巖藻糖、木糖、阿拉伯糖、鼠李糖、半乳糖、甘露糖，Sigma公司。

1.3 儀器與設備

Y15型Enology全自動葡萄酒分析儀，西班牙Biosystems公司；TU-1810型紫外可見分光光度計，北京普析通用儀器有限責任公司；NEXUS型傅里葉變換紅外光譜儀，美國Nicolet公司；ICS5000型離子色譜儀，美國Thermo科技公司；Ultrafle Xtreme型基質輔助激光解析電離串聯飛行時間質譜儀，美國Bruck公司；BF115型7 L發酵罐，美國NBS公司。

1.4 實驗方法

1.4.1 不同起始甘油濃度對發酵的影響

保持基礎搖瓶發酵培養基其他成分不變，起始甘油質量濃度分別設置為20、40、60、100 g/L，30 ℃，200 r/min，發酵96 h，考察碳源濃度對發酵的影響。

1.4.2 甘油補料對發酵的影響

起始甘油質量濃度為20 g/L，分別在36 h補加10或20 g/L甘油，在48 h補加10或20 g/L甘油，考察甘油補料對發酵的影響。

1.4.3 單一氮源對發酵的影響

分別使用酵母粉或硫酸銨作為單一氮源，將起始質量濃度分別設置為1、2、3、4、5、6 g/L，30 ℃，200 r/min，發酵96 h，考察單一氮源對發酵的影響。

1.4.4 復合氮源對發酵的影響

設置酵母粉質量濃度為4 g/L，分別在發酵培養基中添加1、2、3、4、5、6 g/L硫酸銨，30 ℃，200 r/min，發酵96 h，考察復合氮源對發酵的影響。

1.4.5 裝液量對發酵的影響

在500 mL三角瓶中將裝液量分別設置為25、50、75、100 mL，30 ℃，200 r/min，發酵96 h，考察轉速對發酵的影響。

1.4.6 轉速對發酵的影響

將搖床轉速分別設置為160、180、200、220 r/min，30 ℃，發酵96 h，考察裝液量對發酵的影響。

1.4.7 pH對發酵過程的影響

在培養基中分別添加0、1、2、3、4、5 g/L CaCO3，30 ℃，發酵96 h，考察pH對發酵的影響。

1.4.8 低聚糖的提取

將發酵液于4 ℃、8 000 r/min離心20 min，取上清液加3倍體積乙醇，4 ℃過夜后，4 ℃、8 000 r/min離心20 min，取上清液補加3倍體積無水乙醇，4 ℃過夜后，4 ℃、8 000 r/min離心20 min，得到的白色沉淀為低分子質量β-1,3-葡聚糖(以下簡稱低聚糖)。

1.4.9 糖的純化

配制Sevag試劑[V(氯仿)∶V(正丁醇)=4∶1]，按照V(糖溶液)∶V(Sevag試劑)=3∶1比例，將二者混合振蕩30 min，4 ℃，8 000 r/min離心10 min，取上清液重復除蛋白后，采用Sep-Pak C18固相萃取柱(1 g，Waters)再次除蛋白。用紫外分光光度計在200～500 nm進行波長掃描，確保多糖中沒有蛋白質殘留。

1.4.10 分析方法

1.4.10.1 發酵液中甘油殘余量的測定

將2 mL發酵液于4 ℃，8 000 r/min離心10 min后，取上清液用全自動葡萄酒分析儀測定發酵液中的甘油殘余量。

1.4.10.2 發酵液中無機氮、伯胺氮殘余量的測定

將2 mL發酵液于4 ℃，8 000 r/min離心10 min后，取上清液用全自動葡萄酒分析儀測定發酵液中的無機氮及伯胺氮殘余量。

1.4.10.3 生物量的測定

取3 mL發酵液充分混勻后，稀釋一定倍數，以未接種的培養基為空白，用紫外分光光度計在600 nm處測定吸光度。另取3 mL發酵液于4 ℃，8 000 r/min離心10 min后，沉淀中加入3 mL 0.5 mol/L的NaOH，充分混勻30 min，4 ℃，8 000 r/min離心10 min后，取沉淀于60 ℃烘干，恒重3次后測干重。測得菌體干重與OD600換算得回歸方程為y=0.335 7x-0.251 7。

1.4.10.4 紅外光譜分析

產品的結構采用全反射傅里葉變換紅外光譜儀(Fourier transform infrared spectrometer, FT-IR)，在波數范圍400～4 000 cm-1進行掃描，分辨率為0.5 cm-1。

1.4.10.5 單糖組成分析

單糖組分的測定參考LIU等[17]的方法并略作改動：用2 mol/L三氟乙酸溶解5 mg產品，120 ℃金屬浴酸解12 h，利用高效離子交換層析色譜柱(CarboPacPA20柱，3 mm×150 mm)結合脈沖電流檢測器進行產品單糖組分分析。

1.4.10.6 聚合度分析

利用基質輔助激光解析電離飛行時間質譜(matrix-assisted laser desorption ionization time of flight-mass spectrometer, MALDI-TOF MS)在正離子模式下對產品的質荷比進行分析[18]。

1.4.11 數據處理

采用Origin 8.5軟件繪制圖表并進行數據分析。

2 結果與討論

2.1 培養基組分優化

2.1.1 甘油濃度對發酵的影響

碳源濃度對發酵至關重要，過低或過高都不利于菌體生長及產物累積。甘油是具有高滲作用的物質，作為碳源使用時，濃度過高帶來的高滲環境可能會抑制菌體生長及代謝產物的累積[19]。

由圖1和表1可知，當起始甘油質量濃度分別為60、100 g/L時，0～24 h內OD600平均上升速率及甘油平均消耗速率較低，這直接導致了最終低聚糖的產量較低(分別為2.010和1.648 g/L)。而當起始甘油質量濃度分別為20及40 g/L時，0～24 h內OD600平均上升速率及甘油平均消耗速率相對較高，最終低聚糖的產量較高(分別為2.210、2.421 g/L)。這可能是因為甘油濃度過高時，菌體產生的能量要用于抵御外界高滲環境對自身的迫害[20]，同時用于合成葡聚糖前體物質，導致能量因子多段消耗，菌株的生長和產糖能力因此降低[16]。從圖1及表1可見，20 g/L甘油起始質量濃度，無論是OD值的上升速率還是甘油的利用速率都高于40 g/L甘油起始質量濃度。但是甘油起始質量濃度為20 g/L時，發酵液中的甘油殘余量在36 h降低到8 g/L，48 h已低至6 g/L。綜上，20 g/L甘油前期對菌體生長更有利。

a-生物量(OD600)；b-甘油消耗情況圖1 不同甘油濃度對生物量及甘油消耗的影響Fig.1 Biomassand consumption of glycerol under different glycerol concentration

表1 不同甘油濃度下的生物量(OD600)增長速率、甘油消耗速率及低聚糖產量Table 1 Biomass(OD600)growth rate, glycerol consumption rate and yield at different concentration of glycerol

2.1.2 甘油補料對發酵的影響

由甘油濃度實驗可知，將初始甘油質量濃度設置為20 g/L時，菌體前期生長速率最快，因此將初始甘油質量濃度設置為20 g/L，分別采用在發酵36或48 h補加甘油的策略，結果如表2所示。

表2 不同甘油補料策略下的產糖速率及最終低聚糖產量Table 2 Rate of oligosaccharide production and yield at different supplementation strategies of glycerol

發酵36 h分別向發酵液中補加10或20 g/L甘油，36～48 h產糖速率與未補料相比均有不同程度的提升，分別為0.029以及0.038 g/(L·h)。發酵結束低聚糖產量分別為3.176及2.92 g/L。發酵48 h分別向發酵液中補加10或20 g/L甘油，48～60 h產糖速率分別為0.018及0.023 g/(L·h)，最終產量分別為2.812及2.686 g/L，皆低于在36 h補加甘油。分析原因可能是48 h時體系中甘油殘余量極低，對菌體的正向推動力減弱，產糖能力降低，補加甘油導致菌體不耐受環境中突然增高的滲透壓，因此在48 h時補加甘油不利于菌體生長及低聚糖的累積。

2.1.3 單一氮源對發酵的影響

通常情況下，氮源主要在發酵前期用于菌體生長，構成細胞物質及含氮代謝產物，發酵中后期菌體需要在限制氮源或維持較高C/N的條件下產胞外多糖[21]。但菌體在反復、長時間馴化過程中，微生物許多生理機制也會發生相應的變化以幫助其適應外界環境的變化[22-23]。研究不同氮源及濃度對馴化菌的發酵影響是十分必要的。

分別利用酵母粉或硫酸銨作為單一氮源，分別設置初始質量濃度為1、2、3、4、5、6 g/L，研究單一氮源對發酵的影響。結果如圖2及表3所示，當酵母粉作為單一氮源時，隨著酵母粉質量濃度的增高，生物量與產量皆提高，伯胺氮消耗速率越快，氮源耗盡后，菌體會產水不溶性膠體，酵母粉為4 g/L時，低聚糖產量為1.603 g/L，當酵母粉質量濃度繼續增高時，產量的提高不再明顯，因此，以4 g/L酵母粉添加量較好。當以硫酸銨作為單一氮源時，隨著硫酸銨質量濃度提高，生物量與產量皆提高，但相較于使用酵母粉作為單一氮源時，無論是菌體的生物量還是低聚糖的產量都整體偏低。

a, b-酵母粉作為單一氮源時的生物量(OD600)及伯胺氮消耗情況；c, d-硫酸銨作為單一氮源時的生物量(OD600)及無機氮消耗情況圖2 單一氮源時生物量及氮源消耗情況Fig.2 Biomass and consumption of nitrogen at different single nitrogen source

表3 單一氮源時低聚糖產量 單位：g/L

2.1.4 復合氮源對發酵的影響

根據前述實驗結果，選擇添加4 g/L酵母粉作為有機氮源，分別添加1、2、3、4、5、6 g/L硫酸銨，考察復合氮源對發酵的影響，結果如圖3及表4所示。當硫酸銨為1 g/L時，菌體產生了少量的低聚糖并在氮源耗盡后產水不溶性膠體。當硫酸銨質量濃度為3 g/L時，菌體緩慢消耗無機氮并產低聚糖，產量達到2.612 g/L且不產水不溶性膠體。但當發酵體系中硫酸銨濃度進一步增加時，菌體的生長和產低聚糖能力都降低。綜上，選擇4 g/L酵母粉，3 g/L硫酸銨作為初始復合氮源較益。

表4 復合氮源時低聚糖產量 單位：g/L

a-生物量(OD600)；b-無機氮消耗情況圖3 復合氮源時的生物量及無機氮消耗情況Fig.3 Biomass and consumption of nitrogen at compound nitrogen source

2.2 裝液量對發酵的影響

以甘油為碳源合成低分子質量β-1,3-葡聚糖屬于高耗能過程[24]，改善發酵體系中的溶氧水平可有效促進三羧酸循環合成ATP，為菌體生長及產糖提供能量[25]。搖瓶實驗中，裝液量是溶氧的直接影響因素。為考察溶氧對發酵的影響，在500 mL搖瓶中將裝液量分別設置為25、50、75、100 mL，考察裝液量對發酵的影響，結果如圖4所示。裝液量從25 mL增加到50 mL時，菌體濃度及低聚糖產量幾乎相當，當裝液量為75 mL時，低聚糖產量顯著提高，為2.636 g/L。當裝液量繼續增加至100 mL時，低聚糖產量隨之降低。這是因為高溶氧時菌體對底物的利用速率較快，后期底物濃度偏低，不利于產物的累積；而高裝液量會限制搖瓶中的氧氣擴散，使發酵體系中溶氧水平降低，從而限制了菌體的生長與產物的累積。因此，裝液量為75 mL/500 mL時的溶氧可能是該菌株的較佳溶氧水平。

a-低聚糖產量；b-生物量(OD600)圖4 不同裝液量的產量及生物量Fig.4 Yield and biomass at different medium volume

2.3 pH對發酵的影響

發酵是一種多酶復合反應體系，體系中的pH值影響菌體細胞內各種酶的活性進而影響菌體的生長和產物的合成。多數微生物生長繁殖所需pH與產物累積所需pH不同，兩階段pH控制策略在發酵生產微生物多糖中被廣泛利用[26-27]。在發酵過程中分別設置CaCO3質量濃度為0、1、2、3、4、5 g/L，以維持不同pH值，考察發酵過程中pH的變化與菌體生長、產物累積之間的關系。發酵前24 h各組菌體生長OD600值與pH值幾乎相同，24 h以后各組OD600值、pH值及低聚糖產量出現了差異(數據未顯示)，其中添加2 g/L CaCO3時的低聚糖產量最高，為2.510 g/L(圖5-a)。添加2 g/L CaCO3時，菌體在發酵過程中產糖與pH的關系如圖5-b所示。在24～36 h ，pH為6.5～6.3時，產糖速率最快，為0.060 g/(L·h)。綜上所述，菌體的最佳產糖pH可能為6.3左右。

a-低聚糖終產量； b-添加2 g/L CaCO3時發酵過程中產糖量與pH變化圖5 不同pH下產糖情況Fig.5 Yield at different pH

2.4 7 L發酵罐驗證實驗

在7 L發酵罐上進行搖瓶實驗結果的初步驗證。初始甘油質量濃度為20 g/L，發酵液甘油殘量為10 g/L時補加甘油；以4 g/L酵母粉以及3 g/L硫酸銨作為復合氮源；菌體生長階段0～24 h控制pH為7，菌體產糖階段24～96 h控制pH為6.3；維持通氣比2 vvm-1；攪拌速率150 r/min；發酵96 h。

如圖6所示，發酵0～24 h為菌體生長階段，此階段菌體快速生長，OD600平均上升速率為0.395；發酵24～36 h已有少量低聚糖產生，產糖速率為0.066 g/(L·h)；36～48 h產糖速率顯著提升，為0.117 g/(L·h)；發酵48～60 h，產糖速率為0.119 g/(L·h)；60 h后，產糖速率隨發酵時間的延長逐漸減緩直到96 h發酵結束，低聚糖的產量達到8.03 g/L，結果表明，生長期甘油質量濃度為20 g/L，產糖期甘油濃度為30 g/L并控制產糖期pH為6.3，可大幅度提高低聚糖產量。

a-生物量(OD600)、產糖量及pH變化； b-甘油、無機氮以及伯胺氮殘余量圖6 7 L發酵罐發酵過程中參數變化Fig.6 Changes of parameters during the fermentation in a 7 L fermenter

2.5 產品結構解析

對7 L發酵罐所得產品進行結構分析。產品的紅外光譜特征吸收峰與熱凝膠標準品一致(如圖7-a所示)，樣品在波數891.2 cm-1處有典型的β-糖苷鍵特征吸收峰，而在840和、790 cm-1處無β-糖苷鍵的特征吸收峰，另外在波數為3 340.4、1 640.5、2 900.1 cm-1處有多糖特征吸收峰，1 030.7、1 160.4 cm-1處有吡喃型糖環構型的特征吸收峰。離子色譜單糖組成分析結果如圖7-b所示，樣品中只含有一組峰，其保留時間與標準單糖混合液中葡萄糖的保留時間一致，說明產品僅由葡萄糖組成。MALDI-TOF MS聚合度分析結果如圖7-c所示，出現了m/z為2 956.8、3 118.8、3 280.9、3 442.9、3 605.1的峰，分別對應聚合度為18，19，20，21和22。優化后的產品為低分子質量β-1,3-葡聚糖，聚合度在18～22。其結構特征與優化前搖瓶發酵產物結構一致(詳見參考文獻[16])。

a-FT-IR；b-單糖組成分析(1～7分別是巖藻糖、鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、果糖)；c-MALDI-TOF MS圖7 低聚糖的結構及聚合度分析Fig.7 Analysis of structure and degree of polymerization of oligosaccharides

3 結論

以甘油為碳源，發酵馴化菌Agrobacteriumsp.WS-8E3T產β-1,3-低聚糖，分別進行了碳源、氮源初始濃度的優化，并在搖瓶水平進行補料發酵的初步探索，優化得到起始甘油質量濃度為20 g/L，并在低于10 g/L時補加20 g/L，確定最佳酵母粉與硫酸銨的初始質量濃度分別為4和3 g/L，最佳裝液比為75 mL/500 mL，產糖期最適pH為6.3左右。通過7 L發酵罐的驗證實驗，最終低聚糖產量達到8.03 g/L，相比于未優化前提高386.7%，通過結構鑒定，判定該低聚糖為β-1,3-葡聚糖，聚合度范圍在18～22。