動態調控谷氨酸棒狀桿菌合成4-羥基異亮氨酸

來文梅，譚書煜，史鋒*

1(食品科學與技術國家重點實驗室(江南大學)，江蘇 無錫，214122) 2(工業生物技術教育部重點實驗室(江南大學)，江蘇 無錫，214122)

糖尿病是一種慢性代謝紊亂疾病，以Ⅱ型糖尿病最為常見，并且會帶來一系列的并發癥。早在20年前人們就發現葫蘆巴種子中的活性成分4-羥基異亮氨酸(4-hydroxyisoleucine，4-HIL)具有促進胰島素分泌的生物活性[1]。隨著時間的推移，不斷地有研究證明了4-HIL不僅能促進胰島素的分泌，還具有改善胰島素抵抗，調節脂肪代謝的功能，從而能夠降低血糖血脂[2-4]。因此，4-HIL在治療糖尿病以及肥胖癥方面具有較大的應用前景。

制備4-HIL的方法主要有種子提取法、化學或酶合成法、微生物發酵法[1, 5-6]。目前微生物發酵法是較為經濟、高效、安全的方法。2009年，KODERA等[7]發現了來源于蘇云金芽孢桿菌2e2的α-酮戊二酸(α-ketoglutarate，α-KG)依賴性異亮氨酸雙加氧酶(isoleucine dioxygenase，IDO)，該酶能夠直接催化L-異亮氨酸(L-isoleucine，Ile)生成4-HIL。2015年，本實驗室在Ile生產菌株谷氨酸棒桿菌SN01中表達ido基因，利用菌株自身產生的底物Ile，從頭合成出4-HIL[8]。隨后采用靜態改造策略逐步改造4-HIL的合成途徑，使得4-HIL的產量從56.2 mmol/L提高到(118.3±5.7) mmol/L[9-12]。利用常見的代謝改造策略已經難以再增加4-HIL的產量，并且發酵過程中積累了較多的副產物L-賴氨酸(L-lysine，Lys)。隨后課題組利用Ile激活型生物傳感器Lrp-PbrnFEN協調底物α-KG和O2的供應及IDO的活性，搖瓶發酵后4-HIL產量提高到135.3 mmol/L，但是仍然積累了較多的Lys[13]。如何有效地削減Lys的合成，而又不降低4-HIL的產量成了急需解決的問題。

Lys對細胞的生長至關重要，很難通過基因敲除等靜態代謝工程策略改造Lys合成途徑[14-15]。在實驗室前期的研究中，嘗試采用Lys生物傳感器驅動的編程適應性實驗室進化策略來弱化Lys的合成，但是并沒有有效降低Lys的含量[16]。根據近年來的報道，Lys-OFF核糖體開關能夠感應胞內外Lys的濃度并關閉下游基因的表達[17]。2015年ZHOU等[17]利用Lys-OFF核糖體開關下調gltA的表達，成功地將代謝流由TCA循環引入到Lys合成途徑，最終使谷氨酸棒桿菌的Lys產量提高了63.0%。

本文的整體代謝改造思路如圖1所示，為了減少4-HIL發酵中Lys的合成，首先將來源于大腸桿菌的Lys-OFF核糖體開關整合到谷氨酸棒桿菌Lys合成途徑中關鍵基因dapA的編碼序列前，以便根據胞內外Lys的濃度動態下調dapA的表達，弱化Lys的合成，使Lys的濃度保持在維持細胞生長所需的較低水平上。然后在Lys-OFF整合菌株的基礎上利用Ile傳感器Lrp-PbrnFEN動態調控密碼子優化后的ido的表達，由此合成4-HIL。最后利用Lrp-PbrnFEN動態協調α-KG和O2的供應及IDO的活性，以便提高4-HIL的產量。

圖1 谷氨酸棒桿菌中4-HIL的合成Fig.1 Synthesis of 4-HIL in Corynebacterium glutamicum

1 材料與方法

1.1 菌株和質粒

本研究中使用的菌株和質粒如表1所示。

表1 本文所用的菌株和質粒Table 1 Strains and plasmids used in this paper

1.2 培養基

用于谷氨酸棒桿菌發酵的種子培養基和發酵培養基參照文獻[13]的方法配制。

1.3 實驗方法

1.3.1 Lys-OFF核糖體開關整合菌株的構建

利用傳統的pK18 mobsacB介導的谷氨酸棒桿菌染色體編輯方法[19]，將來自大腸桿菌MG1655的Lys-OFF核糖體開關[17]整合到谷氨酸棒桿菌dapA基因前面，得到D-RS菌株。

1.3.2 Ile傳感器控制的動態表達質粒的構建

1.3.3 Lys動態削減菌株的構建

1.3.4 谷氨酸棒桿菌搖瓶發酵

從甘油管中挑取菌株涂布在添加30 μg/mL卡那霉素的LBB平板上，30 ℃活化40 h；然后將平板上的菌苔刮入添加有30 μg/mL卡那霉素的種子培養基中，30 ℃，200 r/min培養16 h；最后將種子接入發酵培養基中，使發酵液初始OD562為1.8，30 ℃，200 r/min培養144 h，分別在不同時間點取樣，測定發酵過程中氨基酸含量的變化。

1.3.5 發酵參數的測定

每24 h取1 mL的發酵液，分別測定OD562、殘糖和氨基酸的含量。OD562：將發酵液稀釋20倍后，利用紫外分光光度計法測定562 nm下的吸光度。殘糖：將發酵液稀釋100倍后，利用SBA生物傳感儀測定葡萄糖的含量。氨基酸含量的測定：首先用5%的三氯乙酸沉淀發酵液中的蛋白雜質，然后于12 000 r/min離心30 min，去除沉淀。取上清液進行膜過濾，再用HPLC檢測氨基酸含量[13]。

2 結果與分析

2.1 整合Lys-OFF核糖體開關弱化Lys的合成

本文探索采用大腸桿菌Lys-OFF核糖體開關動態負調dapA的表達，來弱化Lys的合成。當Lys的濃度增加時，Lys可以與核糖體開關結合，從而關閉dapA的表達，削弱Lys的合成；當Lys濃度低時，核糖體開關則處于開放狀態，dapA能夠表達，以便使Lys的濃度保持在維持細胞生長所需的較低水平上。通過在dapA基因前整合Lys-OFF核糖體開關來探討它對Lys合成的影響。

2.1.1 整合Lys-OFF核糖體開關對菌株生長的影響

在谷氨酸棒桿菌SN01染色體的dapA編碼序列前整合Lys-OFF核糖體開關，得到D-RS菌株。搖瓶發酵時菌株的生長和耗糖情況如圖2所示，以出發菌SN01作為對照菌株。

a-生長變化；b-殘糖變化圖2 Lys-OFF核糖體開關整合菌株D-RS和 出發菌株SN01的生長和殘糖Fig.2 Cell growth and residual glucose of Lys-OFF riboswitch integrated strain D-RS and initial strain SN01

在整個發酵過程中，Lys-OFF核糖體開關整合菌株D-RS比野生型菌株SN01生長稍慢，最終OD562達到約96。但是D-RS的耗糖趨勢與SN01相似，在0～72 h迅速耗糖，到96 h時葡萄糖已被耗盡。上述結果說明通過在谷氨酸棒桿菌染色體dapA基因編碼序列前整合Lys-OFF核糖體開關來動態負調Lys的合成對菌株的生長產生的影響比較微弱。

2.1.2 整合Lys-OFF核糖體開關對氨基酸合成的影響

在dapA前整合Lys-OFF核糖體開關的主要目的就是為了弱化Lys的合成，于是測定了D-RS和SN01菌株發酵液中所積累的Ile和Lys產量。如圖3所示，在發酵終點，D-RS積累了16.3 mmol/L的Lys，比對照菌株SN01(30.6 mmol/L)低了46.7%。同時，D-RS積累了152.2 mmol/L Ile，比對照菌株SN01(170.4 mmol/L)低了10.7%，但是通過SPSS分析表明無顯著性差異。該結果說明，在SN01的染色體dapA前整合Lys-OFF核糖體開關能夠有效地降低Lys的合成，并且對于4-HIL合成的底物Ile的積累不會產生影響。接下來探究整合Lys-OFF核糖體開關對于菌株4-HIL的產量是否有影響。

a-Lys；b-Ile圖3 動態調控菌株D-RS搖瓶發酵中Ile和Lys的產量Fig.3 Production of Ile and Lys in dynamic strain D-RS after fermented in shake flasks

將靜態表達質粒pJYW4-ido轉入D-RS中表達，構建動態調控菌株D-RS/pJYW4-ido。并將攜帶有pJYW4-ido質粒的SN02作為靜態對照菌株進行搖瓶發酵，并測定發酵過程中4-HIL和Lys產量的變化。如圖4所示，最終D-RS/pJYW4-ido菌株積累了87.4 mmol/L的4-HIL，幾乎與SN02(87.8 mmol/L)相同。而D-RS/pJYW4-ido菌株Lys的含量降低至15.4 mmol/L，比SN02(32.6 mmol/L)低了52.8%。上述結果說明整合Lys-OFF核糖體開關不會對菌株的4-HIL產量產生影響，同時能夠顯著降低Lys的含量。

圖4 動態調控菌株D-RS/pJYW4-ido搖瓶 發酵中4-HIL和Lys的產量Fig.4 Production of 4-HIL and Lys in dynamic strain D-RS/pJYW4-ido after fermented in shake flasks

2.2 用Ile激活型傳感器動態正調ido的表達

IDO是催化Ile合成4-HIL的關鍵酶。ido基因的表達強度對于谷氨酸棒桿菌中4-HIL的產量高低至關重要。在實驗室之前的工作中通過靜態代謝策略不斷地提高IDO的表達水平和活性，但是ido的組成型表達會給細胞帶來較大的代謝負擔，胞內資源會持續性被利用去合成IDO。由于Ile是4-HIL合成的直接前體，因此本文采用Ile生物傳感器Lrp-PbrnFEN動態正調密碼子優化后的ido基因(記作idoU)的表達，并將其轉入D-RS菌株中。目的是探究動態弱化Lys是否會對4-HIL的產量造成影響，以及使用Lrp-PbrnFEN傳感器動態正調idoU的表達是否能進一步提高4-HIL的合成。

2.2.1 用Ile傳感器動態正調ido的表達對菌株生長的影響

對ido進行密碼子優化，從實驗室前期構建的PbrnFEN啟動子文庫中挑選3種啟動子：天然啟動子PbrnFE0，強啟動子PbrnFE7以及中等強度的啟動子PbrnFED5去構建idoU的動態表達質粒pIL-0IU、pIL-D5IU和pIL-7IU。其中PbrnFED5包含2個啟動子區域，分別是PbrnFE5和天然PbrnFE0啟動子。將這3種動態表達質粒轉入D-RS中，得到D-RS-0I、D-RS-D5I和D-RS-7I動態調控菌株。然后構建idoU的靜態表達質粒pJYW4-idoU，并轉入SN01中，得到靜態對照菌株SI。圖5為發酵過程中動態控制菌株D-RS-0I、D-RS-D5I、D-RS-7I和靜態控制菌株SI的生長和耗糖的變化。

從整個發酵過程來看，菌株D-RS-D5I的生長與出發菌株D-RS相似，比對照菌株SI略快。而D-RS-0I菌株與SI相似，比出發菌株D-RS略慢。D-RS-7I的生長略慢于SI菌株。然而D-RS-7I的耗糖與SI相似，略慢于D-RS-0I和D-RS-D5I菌株。上述結果說明在D-RS菌株的基礎上進一步動態調控idoU的表達，不會對菌株的生長造成非常顯著的影響。

a-生長變化；b-殘糖變化圖5 動態調控菌株D-RS-NI和靜態對照菌株SI的 生長和殘糖Fig.5 Cell growth and residual glucose of dynamic strain D-RS-NI and static control strain SI

2.2.2 用Ile傳感器動態正調ido的表達對氨基酸合成的影響

如圖6所示，在發酵終點，D-RS-D5I和D-RS-0I分別積累了116.3、89.8 mmol/L的4-HIL。D-RS-D5I比靜態對照菌株SI的4-HIL產量(89.9 mmol/L)高出29.4%，而D-RS-0I與SI的4-HIL產量相似。這2株菌的Lys含量分別是6.0、5.2 mmol/L，比SI(34.7 mmol/L)分別低出82.7%和85.0%。該結果說明在D-RS的基礎上動態正調idoU的表達，能夠在提高或者不影響4-HIL產量的同時降低Lys的含量。奇怪的是D-RS-7I幾乎沒有產生Ile和4-HIL，而且積累了大量的Lys，因此在后續工作中拋棄該菌株。另外D-RS-0I剩余約30 mmol/L的Ile沒有耗光，猜測該菌株中底物α-KG和O2的供應可能不足，導致剩余的Ile沒有繼續轉化為4-HIL。接下來探究動態協調α-KG和O2的供應對4-HIL產量的影響。

圖6 動態調控菌株D-RS-NI搖瓶發酵中4-HIL、 Ile和Lys的產量Fig.6 Production of 4-HIL, Ile and Lys in dynamic strains D-RS-NI after fermented in shake flasks

2.3 用Ile傳感器組合動態正調ido的表達及α-KG和O2的供應

IDO反應的底物有α-KG和O2，α-KG和O2的協同供應對于增加4-HIL的產量非常重要。實驗室前期采用強啟動子PbrnFE7調控odhI和vgb表達，使4-HIL的產量提高至135.4 mmol/L。因此為了提高4-HIL的產量，在2個D-RS-NI菌株(D-RS-0I和D-RS-D5I)的基礎上，采用PbrnFE7啟動子調控odhI和vgb表達。odhI編碼的OdhI是α-KG脫氫酶復合體(ODHC)的抑制蛋白，該蛋白可以通過抑制ODHC而提高α-KG的供應；vgb編碼的透明顫菌血紅蛋白VHb可以增加細胞對O2的攝取。構建了2株D-RS-NI7O7V動態調控菌株。由此在動態弱化Lys的合成和動態調控ido表達的基礎上，進一步動態調節α-KG和O2的供應。探究該改造策略對菌株生長和4-HIL合成的影響。

2.3.1 動態組合正調ido的表達及α-KG和O2的供應對菌株生長的影響

如圖7所示，在整個發酵過程中，動態菌株D-RS-NI7O7V的生長均比靜態對照菌株SI好。D-RS-0I7O7V和D-RS-D5I7O7V生長趨勢相似，在發酵終點OD562均在110～120。D-RS-NI7O7V菌株的耗糖情況與對照菌株SI相似，在0～72 h迅速耗糖，在96 h耗光培養基中的葡萄糖。由此可見，在D-RS-NI菌株的基礎上進一步動態表達odhI和vgb，不會影響菌株的生長。

a-生長變化；b-殘糖變化圖7 動態調控菌株D-RS-NI-NO-NV的生長和殘糖Fig.7 Cell growth and residual glucose of dynamic strain D-RS-NI-NO-NV

2.3.2 組合動態正調ido的表達及α-KG和O2的供應對氨基酸合成的影響

如圖8所示，在發酵終點，D-RS-0I7O7V和D-RS-D5I7O7V的4-HIL產量分別達到166.0、150.4 mmol/L，相比于各自的出發菌株D-RS-NI，分別提升了84.9%和29.3%。并且這2株菌株都沒有剩余Ile，因此Ile到4-HIL的轉化率都達到了1.0 mol/mol。這2株菌株的Lys含量分別降至6.5、5.8 mmol/L，比靜態對照菌SI(34.7 mmol/L)分別降低了81.2%和83.3%。并且其他雜酸含量也比較低，尤其是D-RS-0I7O7V菌株。綜上所述，在D-RS的基礎上組合動態正調ido的表達及α-KG和O2的供應，能夠加速細胞的生長，進一步提高4-HIL的產量，同時降低副產物Lys的合成。

3 結論

為了在提高4-HIL產量的同時降低Lys的合成，首先在SN01染色體Lys合成途徑的關鍵基因dapA前整合Lys-OFF核糖體開關，動態弱化Lys合成，使Lys的含量降低了46.7%。并且不會對4-HIL的產量產生影響。其次利用TAN在2020年構建的Ile激活型傳感器Lrp-PbrnFEN去控制密碼子優化后的ido的表達，使4-HIL能夠在谷氨酸棒桿菌中高效合成，4-HIL的產量提高至116.3 mmol/L。最后為了進一步提高4-HIL的產量，利用強啟動子PbrnFE7控制odhI和vgb的表達，增強α-KG和O2的供應，搖瓶發酵使4-HIL產量提高至166.0 mmol/L，同時使Lys含量降至6.5 mmol/L。本文的最佳菌株D-RS-0I7O7V搖瓶發酵的4-HIL產量(24.4 g/L)分別比SHI等[20]先前報道的靜態對照菌株SF12(20.6 g/L)高18.4%。該產量也比譚書煜[13]之前報道的由單功能生物傳感器Lrp-PbrnFEN調節的動態菌株ST17(19.9 g/L)高22.6%。然而，D-RS-0I7O7V在搖瓶中的4-HIL產量低于孟靜等[21]對菌株HIL18發酵罐優化后的產量(43.3 g/L)。但是本文結果也是目前報道的谷氨酸棒桿菌搖瓶發酵生產4-HIL的最高產量，并且其他雜酸比較低。本文所采用研究策略為4-HIL的高效合成提供了一種新思路。

a-4-HIL；b-Ile；c-Lys；d-其他氨基酸圖8 動態調控菌株D-RS-NI-NO-NV搖瓶發酵中4-HIL、Ile、Lys和其他氨基酸的產量Fig.8 Production of 4-HIL, Ile, Lys and other amino acids in dynamic strains D-RS-NI7O7V after fermented in shake flasks