凝結芽孢桿菌CGMCC 9951新型抗菌肽的挖掘、表達及活性測定

張婧，吳影,2，古紹彬,2*，馬金亮，田萍萍，趙麗娜，李欣，張杰

1(河南科技大學 食品與生物工程學院，河南 洛陽，471023)2(河南省食品微生物工程技術研究中心，河南 洛陽，471023)

食源性致病菌引起的食品安全問題嚴重威脅人們的生命健康。長期以來濫用抗生素已使多種細菌產生耐藥性，因此，開發新型抗菌劑迫在眉睫?？咕氖怯珊颂求w合成的，可抑制微生物生長或殺死微生物的一類小分子多肽或蛋白，通常具有良好的穩定性和廣譜抑菌活性[1]?？咕牡闹饕志绞绞窃鰪娔さ耐ㄍ感?，破壞膜質子動力勢，并引起膜穿孔，導致細菌裂解死亡[2-3]。因此，抗菌肽不易使細菌產生廣泛的耐藥性，被認為是最具潛力的抗菌劑之一。環肽是抗菌肽中較特殊的一類，肽在核糖體合成后，前導肽會被酶切，碳鏈主鏈頭尾氨基酸殘基脫水縮合形成一個閉合的環[4]。與線性肽相比，環肽表現出更強的熱穩定性和抑菌活性[5]。目前報道的產環肽菌株有糞腸球菌S-48(Enterocin AS-48)[6]、結核鏈球菌(Uberolysin)[7]、拜氏梭菌ATCC 25752(Circularin A)[8]以及枯草芽孢桿菌(Subtilosin A)[9]等，尚未見有產自凝結芽孢桿菌的環肽報道。

隨著測序技術的發展，利用泛基因組和次級代謝產物挖掘軟件，更多的抗菌肽被挖掘和應用。錢文江等[10]對從NCBI數據庫中獲得的33個凝結芽孢桿菌的基因組進行次級代謝產物合成基因簇分析，發現與已知基因簇有同源性的43個基因簇中有11個基因簇與Amylocyclicin高度同源，因此，凝結芽孢桿菌極可能具有Amylocyclicin代謝合成途徑。Amylocyclicin最初發現于解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)FZB42，是一類對革蘭氏陽性菌表現出較高抑菌活性的新型環狀細菌素[11]。

本實驗室前期研究發現，凝結芽孢桿菌(Bacilluscoagulans)CGMCC 9951對志賀氏菌等食源性致病菌表現出良好的抑菌活性，主要抑菌物質是有機酸和抗菌肽，并對次級代謝產物中的有機酸的抑菌特性進行了研究[12]，而抗菌肽尚待深入研究。基于此，開展凝結芽孢桿菌CGMCC 9951的全基因組測序，與次級代謝產物數據庫進行比對，挖掘抗菌肽合成基因簇，并將其中一個抗菌肽基因在大腸桿菌中進行表達，對表達產物進行質譜和抑菌活性驗證，以期為凝結芽孢桿菌CGMCC 9951抗菌肽的進一步研究和應用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

凝結芽孢桿菌(Bacilluscoagulans)CGMCC 9951，單核細胞增生李斯特氏菌(Listeriamonocytogenes) ATCC 19115，實驗室分離保藏菌株，均在LB(Luria-Bertani)肉湯培養基中培養(pH 8.0)。

DNA提取試劑盒、BL21(DE3)感受態細胞、pGEX-4T-1表達載體、異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl β-D-thiogalactoside，IPTG)、3′, 3′, 5′, 5′, -四甲基聯苯胺(tetramethylbenzidine，TMB)顯色試劑盒、蛋白免疫印跡(Western blot)一抗和二抗，生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.2 儀器與設備

Pacbio RS Ⅱ測序儀，Pacific Biosciences公司；JY88-II超聲波細胞破碎儀，天津津立儀器設備科技發展有限公司；QE-OrbitrapTM高場靜電場軌道阱質譜儀、Nanodrop 2000超微量紫外分光光度計，Thermo Fisher公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 總DNA提取

凝結芽孢桿菌CGMCC 9951在37 ℃振蕩培養16 h至生長對數期，8 000 r/min離心10 min收集菌體，按DNA提取試劑盒步驟提取細菌基因組DNA。

采用Qubit 4.0和Nanodrop 2000對基因組DNA進行定量和純度檢測。將高質量的DNA(OD260/280為1.8～2.0；OD260/230為2.0～2.2，DNA總量≥15 μg，質量濃度≥50 ng/μL)用于物種鑒定和后續建庫測序。

1.3.2 文庫構建與基因注釋

采用第三代測序平臺PacBio RS Ⅱ對凝結芽孢桿菌CGMCC 9951進行完成圖測序(北京奧維森基因科技有限公司)。使用SMRT Link v5.0.1工具(PacBio公司)進行reads組裝，GeneMarks(http://topaz.gatech.edu/)進行細菌的編碼基因預測，將編碼基因在蛋白相鄰類的聚簇數據庫(Cluster of Orthologous Groups of Proteins，COG)、京都基因與基因組百科全書數據庫(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)、基因本體論數據庫(Gene Ontology，GO)進行功能注釋。

1.3.3 抗菌肽基因簇挖掘

用antiSMASH 5.0[13]軟件(http://antismash.secondarymetabolites.org/)對次級代謝產物和RiPPPs進行挖掘。將全基因組序列的FAST格式上傳后，選擇“strict”檢測標準，勾選“Known Cluster Blast”、“Active Site Finder”“Sub Cluster Blast”和“RREF indeer”后提交，對獲得的核心肽氨基酸序列與NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)數據庫進行Protein BLAST比對，采用MEGA 5.0軟件運用Neighbor-Joining方法建立基于氨基酸序列和相關環肽的系統發育樹。

1.3.4 抗菌肽結構預測

用Expasy(http://web.expasy.org/protparam/)對抗菌肽的分子質量、等電點、電荷數和不穩定系數進行預測[14]；用TMHMM(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)對跨膜結構域進行預測，用SignalP(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP)對信號肽進行預測，用SOPMA(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html)對二級結構進行分析[15]；用SWISS-MODEL(https://swissmodel.expasy.org/)對三級結構進行模擬[16]。

1.3.5 Region 3抗菌肽質粒構建及表達

質粒構建與驗證：以Region 3成熟肽氨基酸序列為模板，由生工生物工程(上海)股份有限公司設計引物，進行PCR擴增目的產物。通過連接酶將PCR產物和克隆載體進行連接，對克隆載體進行酶切，將目的基因酶連至載體，連接液轉入TOP 10感受態中，并對篩選出的陽性克隆菌株進行測序驗證。

重組蛋白的誘導表達：將陽性克隆轉化感受態細胞大腸桿菌BL21(DE3)于42 ℃熱激后涂布在含50 μg/mL氨芐青霉素的平板上，37 ℃培養過夜；挑取單克隆菌落到含50 μg/mL氨芐青霉素的液體培養基中，37 ℃培養至OD值為0.6時，分別添加0.5和1.0 mmol/L IPTG于16 ℃條件下振蕩培養過夜。

表達檢測：離心收集菌體并重懸于PBS(0.01 mol/L，pH 7.4)，用超聲波細胞破碎儀裂解細胞(300 W，工作5 s，間歇5 s)至懸浮液透亮。離心后收集上清液和細胞碎片，細胞碎片用8 mol/L尿素溶解，再用2 mol/L尿素復性。分別對上清液和細胞碎片制樣，進行SDS-PAGE電泳(12%分離膠，5%濃縮膠)檢測蛋白分子質量，并進行蛋白免疫印跡檢測[一抗為兔抗谷胱甘肽巰基轉移酶(glutathione S-transferase，GST)標簽，二抗為羊抗兔]，采用TMB顯色后觀察試驗結果。

1.3.6 重組蛋白的質譜驗證

將SDS-PAGE凝膠電泳的目標條帶切膠，按照質譜檢測要求處理后送卡梅德生物科技(天津)有限公司鑒定。質譜參數：質譜一級譜掃描范圍350～ 1600m/z；二級質譜模式CID(Elite)。數據使用Proteome Discoverer 2.0(Thermo Fisher公司)進行處理。

1.3.7 抗菌活性驗證

按照1.3.5重組蛋白的誘導表達和檢測方法，每600 mL重組大腸桿菌發酵液菌體超聲波處理后細胞碎片重懸至6 mL為制備樣品。以終濃度為106CFU/mL(涂板計數)的單核細胞增生李斯特氏菌為指示菌，取200 μL涂板，采用牛津杯法[17]檢測融合蛋白的抑菌活性，每個杯中添加200 μL樣品，37 ℃培養24 h后，采用十字交叉法測量透明圈直徑。

2 結果與分析

2.1 總DNA提取的質量檢測

對提取的凝結芽孢桿菌CGMCC 9951的總DNA進行質量檢測。Nanodrop檢測其OD260/280為1.98，OD260/230為2.17；Qubit檢測其質量濃度為208 ng/μL，體積290 μL，總量60.32 μg，其質量和濃度達到建庫要求，進行建庫。

2.2 凝結芽孢桿菌CGMCC 9951全基因組分析

通過第三代測序平臺PacBio RS II對凝結芽孢桿菌CGMCC 9951進行完成圖測序。該染色體基因組為環狀，染色體的總數為1，沒有發現質粒存在，基因組大小為3 608 370 bp，其GC含量為46.18%。

針對測序樣品的組裝基因組序列，結合編碼基因的預測結果，使用Circos軟件對樣品基因組進行展示。如圖1所示，環形圖譜最外圈是基因組序列位置坐標，由外到里分別是編碼基因和基因功能注釋結果(COG、KEGG、GO)。其中COG注釋的基因共有2 434個，占總注釋基因的57.19 %，分為信息存儲與處理、細胞過程和信號、新陳代謝3大類，復制、重組和修復、能量生產和轉換、氨基酸運輸和代謝等24個分類。KEGG注釋的基因有3 358個，占總注釋基因的78.90%，分別從細胞過程、環境信息處理、遺傳信息處理、人類疾病、新陳代謝、有機系統6大部分，細胞生長與死亡、跨膜運輸、信號轉導、復制和修復等27個分類進行基因注釋。GO注釋的基因有2 399個，分別從生物學途徑、細胞學組件和分子功能3大類，生物調節、酶調節活動等47個小分類進行基因注釋。

圖1 凝結芽孢桿菌CGMCC 9951基因組環形圖譜及分類注釋Fig.1 Ring map and taxonomic annotation of the genome of Bacillus coagulans CGMCC 9951

2.3 antiSMASH對凝結芽孢桿菌CGMCC 9951抗菌肽的挖掘

利用antiSMASH軟件對凝結芽孢桿菌CGMCC 9951全基因組次級代謝產物進行分析，共得到6個結果，見表1。其中Region 3和Region 6為核糖體合成和翻譯修飾后的肽產物(RiPP)簇，即潛在的目的產物抗菌肽。Region 1是T3PKS合成酶(Ⅲ聚酮化合物)，Region 2是硫肽類抗生素，Region 4是β-內酯含蛋白酶抑制劑，Region 5是萜烯類化合物。

表1 antiSMASH對次級代謝產物的預測Table 1 Prediction of secondary metabolites by antiSMASH

Region 3和Region 6的合成基因簇及核心肽氨基酸序列見圖2。

圖2 Region 3和Region 6的合成基因簇及 核心肽氨基酸序列Fig.2 Synthesis of Region 3 and Region 6 gene clusters and amino acid sequences of core peptides

將2個氨基酸序列在NCBI的Protein BLAST數據庫進行同源性比對，基于氨基酸序列的系統發育樹分析結果(圖3)，發現Region 3與Amylocyclicin的相似度較高，而Region 6在數據庫無比對結果。Amylocyclicin是由解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)FZB42的核糖體產生的新型環狀細菌素，對革蘭氏陽性菌有較高的抑菌活性，其在N端Leu和C端Try之間脫水縮合形成環化，成熟環肽的分子質量為6 381 Da(未環化肽的分子質量為6 399 Da，相差1個H2O分子)[11]。最終，選擇Region 3進行表達，開展后續實驗。

圖3 Region 3基于氨基酸序列和相關環肽的系統發育樹Fig.3 Phylogenetic tree of Region 3 based on amino acid sequences and related cyclic peptides

2.4 Region 3抗菌肽的結構預測

通過Expasy分析一級結構，Region 3成熟肽由64個氨基酸殘基組成，分子式為C291H488N72O84S1，6 371.57 Da，氨基酸分布見圖4-a。此外，預測到負電荷殘基總數為2，正電荷殘基總數為7，正電荷數目的增加可提高抗菌肽與細菌細胞膜的結合能力，降低抑菌濃度[18]。其次，預測不穩定系數為4.28，遠小于40，歸為穩定蛋白，良好的穩定性有助于抗菌肽的加工和保存。

a-氨基酸分布；b-疏水性；c-信號肽分析； d-跨膜區分析圖4 Region 3抗菌肽理化性質預測Fig.4 Prediction of physicochemical properties of Region 3 antimicrobial peptide

疏水性如圖4-b所示，多肽鏈呈兩親性，平均系數為0.841，歸為疏水蛋白。疏水性是影響抗菌活性的重要因素之一，疏水性太低會導致抗菌肽與細菌細胞膜的親和力過低而不易結合，太高易導致抗菌肽自我聚集而降低溶解度[19]。一般細胞內部大多為親水性蛋白，膜蛋白親水性通常較差，故推測該抗菌肽可能是結合在細菌細胞膜上的一個小分子蛋白。信號肽分析結果見圖4-c，表示剪切位點存在可能性的C值最大值在第41位氨基酸殘基，在此區域有可能出現剪切位點，其次為第52位氨基酸殘基。信號肽存在可能性S值和綜合分析值Y值均未超過閾值0.5，表明該抗菌肽不存在信號肽區域。使用TMHMM進行跨膜區分析結果見圖4-d。該肽含有一個跨膜螺旋域，肽鏈一端在膜外，一端在膜內。綜上分析，該肽為一個帶正電荷、疏水的、結構穩定的膜上蛋白，根據預測的理化性質進行下一步表達載體的選擇和構建。

如圖5-a所示，Region 3抗菌肽二級結構主要由α螺旋、β轉角、延伸鏈和無規卷曲構成，其中有43個氨基酸參與α螺旋的形成，占67.19%；5個氨基酸參與β轉角的形成；有10個氨基酸參與延伸鏈的形成；6個氨基酸參與無規卷曲的形成。SWISS-MODEL同源建模三級結構預測如圖5-b所示，以NKP-5-3B為模板(氨基酸序列見圖5-c)，兩者氨基酸序列重復率為60.9%，三級結構高度相似，都是由4個緊密堆積的α螺旋結構組成。研究表明，α螺旋可能是膜滲透和抗菌活性所必需的[20]，大多數抗菌肽在水溶液中是線性無結構的，當與目標膜結合時，才折疊成螺旋結構，并且只有當α螺旋抗菌肽序列超過一定長度，才足以跨越整個細菌膜，形成通道而殺死細菌[21-22]。

a-抗菌肽二級結構；b-抗菌肽三級結構；c-樣品和模板氨基酸序列圖5 Region 3抗菌肽結構預測Fig.5 Prediction of Region 3 antimicrobial peptide structure

因此，以α螺旋為主要結構的Region 3抗菌肽可能具有良好的抑菌活性。

2.5 Region 3抗菌肽的表達

為了方便后期制備和純化抗菌肽，采用帶有GST標簽的載體和大腸桿菌原核表達系統。目的氨基酸序列為LASTLGISTAAAKKAIDIIDTASTIASIISLIGVV-TGAGAISYAVVATAKAMIKKYGKKYAAAW(載體信息見圖6-a)，表達的融合蛋白總長度為290個氨基酸，分子質量32 658.4 Da，等電點為8.27。對重組質粒進行酶切，電泳結果如圖6-b所示，條帶位于5 000 bp的是載體，小于500 bp的是目的基因(192 bp)，說明重組質粒構建成功。將重組質粒轉化到TOP 10感受態細胞中，檢測篩選出陽性克隆的質粒，測序驗證無誤后再轉化到E.coliBL21(DE3)感受態細胞中，所得菌株即為構建好的表達菌株。

a-載體信息；b-重組質粒酶切圖6 載體及重組質粒酶切Fig.6 Vector and recombinant plasmid digestion

通常情況下，低溫環境會降低細菌的蛋白表達速度，減少包涵體形成。例如黃夏冰等[23]在37 ℃用不同濃度IPTG誘導表達的蛋白均為包涵體，將溫度降低至15 ℃時，誘導產物絕大部分為可溶蛋白，且在0.5 mmol/L IPTG條件下可溶性蛋白表達量最高。因此，將重組大腸桿菌先在37 ℃培養至OD值為0.6后，再添加IPTG于16 ℃低溫培養過夜，然后將離心菌體超聲波破碎后的上清液和破碎細胞進行SDS-PAGE，結果見圖7-a。添加0.5和1.0 mmol/L IPTG誘導劑的細胞沉淀在32 kDa處都有表達條帶，且0.5 mmol/L的IPTG表達量更大；而加入0.5和1.0 mmol/L IPTG誘導的細胞上清液在32 kDa位置條帶都很淺，說明表達蛋白主要是在細胞碎片中。此外，蛋白免疫印跡檢測圖譜顯示，在32 kDa出現印記條帶(見圖7-b箭頭所指)，證明成功表達了融合蛋白。

圖7 抗菌肽的SDS-PAGE(a)及Western blot(b)分析圖Fig.7 SDS-PAGE(a) and Western blot(b) analysis of antimicrobial peptides注：M-Protein Marker;1-未誘導表達總蛋白;2-16 ℃上清液, 0.5 mmol/L IPTG;3-16 ℃沉淀, 0.5 mmol/L IPTG; 4-16 ℃上清液, 1.0 mmol/L IPTG;5-16 ℃沉淀, 1.0 mmol/L IPTG

2.6 融合蛋白的質譜驗證分析

通過蛋白質譜覆蓋試驗檢測到一條肽段，氨基酸序列為ERAEISMLEGAVLDIR，是GST標簽蛋白第88位到103位氨基酸序列，總離子流圖和目標肽段離子流圖見圖8。GST標簽蛋白可以增大目標蛋白的溶解性，也為進一步分離純化目的蛋白奠定基礎。通過質譜分析成功檢測到了GST標簽蛋白的多肽片段，表明重組大腸桿菌成功表達了融合蛋白。

a-總離子流圖；b-目標肽段離子流圖圖8 總離子流圖和目標肽段離子流圖Fig.8 Total ion flow diagram and target peptide ion flow diagram

2.7 融合蛋白活性驗證

融合蛋白活性驗證結果見圖9，添加0.5 mmol/L IPTG于16 ℃誘導表達的大腸桿菌的超聲波處理后細胞碎片對單核細胞增生李斯特氏菌有良好的抑菌活性，抑菌圈直徑為(15.2±1.4)mm，而IPTG濃度增至1.0 mmol/L時對指示菌抑制效果稍弱，這與誘導表達的SDS-PAGE結果相一致，而未誘導表達的大腸桿菌則沒有抑菌活性。因此，融合蛋白具有抑菌活性證實Region 3是編碼抗菌肽的基因，且利用原核表達體系表達的融合蛋白具有較好的抗菌活性。相似的，丁靜等[24]利用大腸桿菌表達的人源抗菌肽LL-37對多種常見的細菌均有較好的抑制作用。此外，王蓮哲等[25]利用畢赤酵母GS115表達的樹蛙抗菌肽Cathelicidin對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌都有良好的抑菌活性。因此，通過異源表達可以獲得大量抑菌性能優良的抗菌肽，為進一步的機理研究和應用奠定基礎。

a-0.5 mmol/L IPTG誘導細胞碎片；b-1.0 mmol/L IPTG 誘導細胞碎片；c-未誘導細胞碎片圖9 重組蛋白抑菌活性Fig.9 Antibacterial activity of recombinant protein

3 結論

凝結芽孢桿菌CGMCC 9951具有廣譜抑菌活性和優良的熱穩定性[12, 26]，應用前景良好。但目前從微生物發酵液中大量獲取抗菌肽純品較為困難，不利于研究應用。因此，本研究通過對凝結芽孢桿菌CGMCC 9951的次級代謝產物進行挖掘，并與NCBI數據庫比對，選擇與Amylocyclin具有較高相似性的Region 3核心肽氨基酸序列進行表達。通過一系列結構分析軟件，對Region 3核心肽氨基酸序列進行分析，預測其成熟肽分子質量為6 371.57 Da，帶正電荷，呈疏水性穩定蛋白。選擇大腸桿菌原核表達系統對Region 3核心肽進行表達，采用0.5 mmol/L IPTG和16 ℃低溫過夜培養對目的蛋白進行誘導表達以減少包涵體的形成。SDS-PAGE、蛋白免疫印跡和質譜驗證結果表明成功構建了Region 3蛋白原核表達系統，且表達的蛋白主要位于細胞碎片中，對單核細胞增生李斯特氏菌表現出良好的抑菌活性。融合蛋白的成功表達為后續的純化、性質、抑菌機理和應用研究奠定基礎。