溶源性發酵乳桿菌噬菌體的誘導及滅活方法

郭蛇，許銘，張燦，朱含芳，陳霞

(內蒙古農業大學, 乳品生物技術與工程教育部重點實驗室，農業農村部奶制品加工重點實驗室， 內蒙古自治區乳品生物技術與工程重點實驗室，內蒙古 呼和浩特，010018)

發酵乳桿菌是一類具有耐酸、耐膽鹽、降解不易消化糖類等優良特性的專性異型發酵乳酸菌，普遍存在于自然發酵制品以及人類和動物的腸道中[1-4]。發酵制品的生產和感官特性主要依賴于發酵劑的穩定性，在發酵過程中，發酵劑若被噬菌體侵染，則可能影響食品風味和口感。目前，噬菌體污染已被認為是乳制品行業發酵失敗的主要原因[5]。

噬菌體具有很強的感染力，發酵劑被噬菌體污染后活力下降，可能出現發酵緩慢，pH值不正常等情況。除烈性噬菌體外，溶原性噬菌體污染也是引起發酵失敗的原因之一，它由特定的基因來引導整合至細菌染色體，并作為原噬菌體保持休眠狀態，在特定物理或化學條件下，部分溶原性噬菌體可被誘導為烈性噬菌體，從而影響發酵的進行[6-8]。在發酵食品的生產過程中，噬菌體有多種污染途徑，發酵劑菌株可以通過進化出噬菌體抗性系統來自然地防止噬菌體的入侵[9]，在材料和工業設施上使用物理化學方法也可以防止噬菌體污染，如熱處理、使用化學殺菌劑等[10]。

本研究以發酵乳桿菌(Lactobacillusfermentum)IMAU32579為研究對象，通過紫外線和絲裂霉素C對其進行誘導，并評估熱處理及常見化學殺菌劑對誘導出的噬菌體的滅活效果，為工業生產中噬菌體防治措施的建立提供數據支持和理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

發酵乳桿菌(Lactobacillusfermentum)IMAU32579保藏于內蒙古農業大學乳品生物技術與工程教育部重點實驗室。

1.1.2 培養基

MRS液體培養基(g/L)：植物蛋白胨10，酵母粉5，牛肉膏10，葡萄糖20，檸檬酸鈉2，無水乙酸鈉5，MnSO40.054，MgSO40.2，吐溫-80 1 mL，121 ℃滅菌15 min。

MRS固體培養基：MRS培養基中加入15 g/L的瓊脂，121 ℃滅菌15 min。

MRS半固體培養基：MRS培養基中加入7 g/L的瓊脂，121 ℃滅菌15 min。

RSM(100 mL)：10 g脫脂乳，115 ℃滅菌15 min后立即取出，迅速急冷。

TMG：10 mmol/L Tris-HCl、10 mmol/L MgSO4、1 g明膠，加水至1 L、pH調至7.4，121 ℃滅菌15 min。

1.1.3 試劑與儀器

絲裂霉素C，羅恩試劑公司；乙醇、異丙醇、NaClO，天津鑫伯特化工有限公司。

UV-1700紫外可見分光光度計，日本島津株式會社分析儀器部；DHP-9272電熱恒溫培養箱，上海一恒科學儀器有限公司；DL-CJ-2F超凈工作臺，北京東聯哈爾儀器制造有限公司；Eppendorf 5810R臺式高速冷凍離心機，德國 Hambury 公司;JEM-1200透射電子顯微鏡，日本JEOL公司 。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌株的活化

將發酵乳桿菌IMAU32579以2%(體積分數，下同)接種量接種于5 mL MRS液體培養基中，置于37 ℃培養24 h，得到第一代菌。將第一代菌液傳代兩次后，得到第三代培養菌株，置于4 ℃冰箱備用。

1.2.2 菌株的誘導

1.2.2.1 紫外線誘導

在超凈工作臺中，將5 mL菌液(OD600≈0.4)注入培養皿中緩慢搖動使其平鋪后，打開培養皿蓋，置于紫外燈(254 nm)下，使菌液液面與紫外燈距離為10～15 cm，分別照射10、20、30、40、50 s，以未照射菌液為對照。37 ℃培養，每隔1 h取樣測定OD600值，重復3次。將誘導液8 000×g，5 min離心過濾，即獲得可能的噬菌體裂解液，采用雙層平板法檢測是否存在噬菌斑。

1.2.2.2 絲裂霉素C誘導

在處于遲滯期(OD600≈0.2)的菌液中添加絲裂霉素C使其終質量濃度分別達到1.8、1.9、2.0、2.1、2.2 μg/mL，以不添加絲裂霉素C的空白組作為對照。37 ℃培養，每隔1 h測定其OD600值，重復3次。將誘導液8 000 ×g，5 min離心過濾，即獲得可能的噬菌體裂解液，采用雙層平板法檢測是否存在噬菌斑。

1.2.3 噬菌體增殖

將已活化的宿主菌以2%的接種量接入MRS培養基中，37 ℃培養至OD600≈0.5，加入噬菌體裂解液，37 ℃培養3～4 h直至菌液澄清。8 000×g離心5 min后收集上清液得到噬菌體懸浮液，經0.22 μm無菌濾膜過濾得到噬菌體裂解液。置于4 ℃冰箱備用。

1.2.4 噬菌體的濃縮和檢測

將RNase A、DNase I加入溶源性發酵乳桿菌裂解液中至終質量濃度1 μg/mL，37 ℃靜置30 min。然后加入終濃度為0.5 mol/L的NaCl和100 g/L的聚乙二醇8000冰浴4 ℃過夜后取出，12 000×g離心20 min后得到的沉淀重新溶解于SM緩沖液中。將經過濃縮之后的噬菌體裂解液進行雙層平板法計數。

1.2.5 噬菌體形態觀察

取效價達到108PFU/mL噬菌體原液用作電鏡觀察。取微量噬菌體懸液滴加于復膜銅網上，滴1滴2%磷鎢酸(pH 7.0)，靜置滴染30 s后，用濾紙吸去未干的染液，放置在室溫下自然干燥，然后使用透射電子顯微鏡觀察噬菌體的形態。

1.2.6 不同溫度對噬菌體的滅活效果

配制MRS、RSM、TMG培養基，分別分裝900 μL于1.5 mL EP管中。將100 μL噬菌體裂解液分別加入上述培養基中混合搖勻，分別進行63、72 ℃水浴培養，將不同時間間隔下(0、1、2、3、4、5 min)的噬菌體裂解液取出，以10倍梯度稀釋噬菌體裂解液，采用雙層平板法對不同培養條件下的噬菌體計數，37 ℃培養24 h，計算其滅活效果。

城鎮住房民生狀況可以用以下三個指標來反映。人均住房面積、房價收入比、住房消費占總消費比三個指標分別從住房使用價值、住房支出負擔、整個消費結構三個方面體現了住房民生的狀況。

1.2.7 化學殺菌劑對噬菌體的滅活效果

1.2.7.1 乙醇對噬菌體的滅活效果

分裝900 μL不同體積分數(10%、20%、30%、50%、75%、100%)乙醇溶液于1.5 mL EP管中，然后分別加入100 μL噬菌體裂解液，混合均勻，37 ℃培養，于不同時間間隔下(0、15、30、45、60 min)取出，采用雙層平板法對不同濃度乙醇處理下的噬菌體計數，37 ℃培養24 h，計算其滅活效果。

1.2.7.2 異丙醇對噬菌體的滅活效果

分裝900 μL不同體積分數(10%、30%、50%、100%)異丙醇溶液于1.5 mL EP管中，然后分別加入100 μL噬菌體裂解液，按1.2.7.1的方法計算其滅活效果。

1.2.7.3 NaClO對噬菌體的滅活效果

分裝900 μL不同質量濃度(100、200、400、800 mg/L)NaClO溶液于1.5 mL EP管中，然后分別加入100 μL噬菌體裂解液，按1.2.7.1的方法計算其滅活效果。

1.2.8 數據統計與分析

所有獨立試驗均進行3次重復。數據均采用Origin 2018軟件作圖分析。使用SPSS軟件，采用單向方差分析，比較數據間顯著性差異(P<0.05)。

2 結果與分析

2.1 發酵乳桿菌的誘導

紫外線照射可使噬菌體由溶原途徑進入裂解途徑，是較為經典的誘導方法[11]。發酵乳桿菌菌懸液經過紫外(254 nm)照射不同時間以及不同培養時間下OD600值的變化情況如圖1所示。發酵乳桿菌IMAU32579經5個不同時間段的紫外照射后，5種誘導液自0 h開始菌體密度較對照菌開始下降，但對上述誘導液進行雙層平板法檢測時，均未有噬菌斑出現。

圖1 發酵乳桿菌IMAU32579經紫外線誘導 后的OD600值的變化Fig.1 Changes in the OD600 values of Lactobacillus fermentum IMAU32579 after UV induction

郭靜[12]將甲基營養型芽孢桿菌置于紫外燈(254 nm)下，照射40 s后，其誘導液的OD600值呈先下降后上升的趨勢，對誘導液進行雙層平板檢測，發現有噬菌斑產生。楊敏[13]對30株水稻白葉枯病菌進行紫外照射誘導，結果顯示僅成功誘導出2株噬菌體，28株未誘導出噬菌體，說明還有其他原因影響誘導能力。

有研究報道，前噬菌體具有一個緊密的抑制系統用來維持其穩定的休眠狀態，雖可在某些外界刺激條件下被誘導，但是否可被成功誘導與菌株特性、前噬菌體穩定性等多種因素有關[14]。本研究菌株經紫外照射后，雖然其OD600值有所降低，但并未成功誘導出噬菌體。推測OD600值下降的原因可能是由于紫外照射而引起的菌株生長抑制。

2.1.2 絲裂霉素C對發酵乳桿菌的誘導

絲裂霉素C是從頭狀鏈霉菌培養液中分離提取的一種抗生素，能夠使細胞DNA解聚，阻止DNA的復制，是一種常見的噬菌體誘導劑[15]。PEI等[16]使用0.7 μg/mL絲裂霉素C誘導142株乳酸菌，結果表明，在添加誘導劑后8 h內，所有受試菌中有8株菌株裂解，產生噬菌體。因此，本研究使用絲裂霉素C為誘導劑，對發酵乳桿菌IMAU3257進行誘導。

由圖2可知，經不同濃度絲裂霉素C誘導后的誘導液在培養1 h后，OD600值雖低于對照組，但仍呈上升趨勢。隨著培養時間的增長，菌株生長受到抑制，OD600值下降，推測可能有噬菌體存在。對上述誘導液進行雙層平板法檢測后發現，絲裂霉素C質量濃度為1.9 μg/mL，培養時間為6 h時，有噬菌斑產生，說明成功誘導出噬菌體。

圖2 發酵乳桿菌IMAU32579經絲裂霉素C誘導 后的OD600值的變化Fig.2 Changes in the OD600 values of L.fermentum IMAU32579 after mitomycin C induction

2.2 噬菌體的形態

經1.9 μg/mL絲裂霉素C誘導后，雙層平板上觀察到清晰透明的噬菌斑(圖3-a)，將該噬菌體命名為LFP-VB1。利用透射電子顯微鏡觀察噬菌體形態，結果如圖3-b所示。由圖3-b可知，噬菌體LFP-VB1的頭部直徑為(62.86±2.01) nm，尾部為非收縮性尾，長(259.26±2.00) nm，寬(12.52±2.01) nm。依照國際病毒分類委員會分類標準[17]，該噬菌體屬于尾噬菌體目(Caudovirales)、長尾噬菌體科(Siphoviridae)。

a-噬菌斑圖；b-電鏡圖圖3 噬菌體LFP-VB1的噬菌斑及電鏡圖Fig.3 Phage plaque and electron micrograph of phage LFP-VB1

2.3 不同溫度對噬菌體LFP-VB1的滅活效果

熱處理是最常用的傳統滅活微生物的方法，其作用機理是利用加熱使微生物的蛋白質、核酸等發生不可逆變性，致使其失活。

如圖4所示，噬菌體LFP-VB1對高溫極敏感。當溫度為63 ℃時，用3種培養基培養的噬菌體，在處理4 min均可失活；72 ℃時，噬菌體對數級下降速率較63 ℃更快，但同樣在4 min時完全失活。

TRUCCO等[18]測定了德氏乳桿菌溫和噬菌體(Cb1/204和Cb1/342)在不同溫度和不同培養基(RSM和MRS)下的活性，結果顯示,溫度為63 ℃時，噬菌體Cb1/204和Cb1/342在MRS完全失活所需要的時間為10 min和20 min，在RSM培養基中處理30 min后仍無法全部滅活；在72 ℃處理后顯示，兩種溫和噬菌體快速失活。林澤永等[19]使用63 ℃和72 ℃處理短乳桿菌烈性噬菌體，噬菌體分別在處理10 min和5 min時，完全滅活。

上述研究結果顯示，發酵乳桿菌噬菌體LFP-VB1不具有耐熱性，63 ℃處理4 min即可完全失活。因此，可通過熱處理控制噬菌體LFP-VB1的污染。

圖4 在63 ℃和72 ℃不同培養基對噬菌體 LFP-VB1的滅活作用Fig.4 Effect of different culture medium at 63 ℃ and 72 ℃ on the inactivation of phage LFP-VB1

2.4 不同化學殺菌劑對噬菌體LFP-VB1的滅活效果

2.4.1 乙醇對噬菌體LFP-VB1的滅活效果

乙醇是一種安全有效的化學殺菌劑，可通過破壞蛋白質的肽鍵，進而使噬菌體衣殼蛋白的結構發生改變，最終達到滅活效果[20-21]。將發酵乳桿菌噬菌體LFP-VB1置于不同濃度乙醇溶液中處理60 min后的滅活效果如圖5所示。

圖5 不同濃度乙醇對噬菌體LFP-VB1的滅活效果Fig.5 Effect of ethanol concentration on the inactivation of phage LFP-VB1

由圖5可知，10%和20%的乙醇對噬菌體LFP-VB1的滅活效果較差；30%乙醇處理60 min后，噬菌體LFP-VB1的效價下降1.58個對數級；體積分數為75%和100%的乙醇在處理前15 min對噬菌體的滅活效果較強，分別使其下降3.02和2.93個對數級，隨著處理時間增加，滅活效果減弱，處理60 min后，噬菌體分別下降4.71和4.21個對數級，100%乙醇的滅活效果在60 min后低于75%乙醇，原因可能是乙醇濃度過高導致噬菌體表面蛋白質迅速凝固，形成一層膜，阻止乙醇溶液向噬菌體內部流入，使其滅活效果受到影響[22]。

CAPRA等[23]評價了不同濃度乙醇對乳酸菌噬菌體PL-1和J-1的滅活效果，結果顯示，10%和50%的乙醇對噬菌體活性幾乎沒有影響(T99>45 min)，75%和100%的乙醇是滅活噬菌體PL-1和J-1的最有效溶液，T99值的范圍為5.5～10.3 min。林澤永等[19]評價了不同濃度乙醇對短乳桿菌噬菌體φB23的滅活效果，結果表明用75%的乙醇溶液處理10 min時，可使噬菌體完全失活；當乙醇溶液體積分數為50%時，噬菌體效價下降較慢，處理20 min后完全滅活；當采用30%的乙醇處理，30 min內不能使其失活[19]。本研究中，不同濃度的乙醇對噬菌體LFP-VB1的活性影響較小，60 min內處理后，均不能使其完全失活，說明噬菌體LFP-VB1對乙醇的耐受性較高。

2.4.2 異丙醇對噬菌體LFP-VB1的滅活效果

將發酵乳桿菌噬菌體LFP-VB1置于不同濃度異丙醇溶液中處理60 min后的滅活效果如圖6所示。

圖6 不同濃度異丙醇對噬菌體LFP-VB1的滅活效果Fig.6 Effect of isopropanol concentration on the inactivation of phage LFP-VB1

由圖6可知，用10%、20%、50%、100%異丙醇處理15 min，噬菌體效價分別下降0.98、1.17、1.33和0.58個對數級，隨著處理時間延長，滅活效果減弱，效價下降趨勢穩定。30%異丙醇處理60 min滅活效果最佳，使噬菌體下降2.28個對數級。研究表明，100%的異丙醇處理5 min可使Lactobacillushelveticus噬菌體CNRZ832-B1和CNRZ0241完全失活[24]， 處理15 min可使嗜熱鏈球菌噬菌體031-D完全失活[25]。對于本研究來說，異丙醇溶液對噬菌體LFP-VB1的滅活效果較差，100%異丙醇作用60 min，仍不可使噬菌體完全滅活，說明與上述噬菌體相比，噬菌體LFP-VB1對異丙醇的抗性較強。

2.4.3 NaClO對噬菌體LFP-VB1的滅活效果

由圖7可知，100 mg/L NaClO處理60 min的滅活效果最差，僅使噬菌體下降1.83個對數級；隨著NaClO濃度及處理時間增加，其對噬菌體LFP-VB1的滅活作用增強。質量濃度為800 mg/L，處理60 min，滅活效果最佳，但也未能使噬菌體LFP-VB1完全滅活，僅使其下降6.29個對數級。SUREZ等[7]研究發現，100 mg/L NaClO可使乳球菌噬菌體001和QF12在5 min內完全滅活；噬菌體046和QP4經100 mg/L NaClO處理后，T99值分別為32.7和8.8 min，300和200 mg/L的NaClO可使它們分別在45 min、30 min后完全失活，NaClO可有效滅活上述乳球菌噬菌體。另有研究表明，800 mg/L NaClO對噬菌體活力的影響最大，15 min時可使植物乳桿菌噬菌體B2完全失活，30 min時可使噬菌體B1、FAGK1、FAGK2完全失活；400 mg/L的NaClO效果略差，5 min內使4種噬菌體達到99%滅活；200 mg/L的NaClO對噬菌體滅活效果不佳，達到99%滅活的時間均大于45 min[26]。對于本研究來說，NaClO濃度越高對噬菌體滅活效果越佳，但800 mg/L NaClO作用60 min后，仍不能使噬菌體完全失活，說明與上述噬菌體相比，噬菌體LFP-VB1對NaClO的抗性較強。

圖7 不同濃度NaClO對噬菌體LFP-VB1的滅活效果Fig.7 Effect of NaClO concentration on the inactivation of phage LFP-VB1

3 結論

本研究以發酵乳桿菌IMAU32579為研究對象，通過1.9 μg/mL絲裂霉素C成功誘導出發酵乳桿菌噬菌體。該噬菌體屬于長尾噬菌體科，命名為LFP-VB1。LFP-VB1對溫度較為敏感，63 ℃處理即可使其完全失活；對常見化學殺菌劑(乙醇、異丙醇、NaClO)不敏感，800 mg/L NaClO處理60 min也僅能使其下降6.29個對數級。本研究可為構建噬菌體防治措施，提高相關產品穩定性提供理論基礎。