pH偏移誘導對大豆親脂蛋白納米顆粒及其解離締合行為的影響

李次力，高遠，曾劍華，孫冰玉，黃雨洋，朱秀清

(哈爾濱商業大學 食品工程學院，黑龍江省普通高校食品科學與工程重點實驗室， 黑龍江省谷物食品與綜合加工重點實驗室，黑龍江 哈爾濱，150028)

大豆親脂蛋白(soybean lipophilic protein，SLP)是大豆球蛋白(11S)和伴大豆球蛋白(7S)在蛋白分離或加工過程中發生蛋白和磷脂結合形成的親脂蛋白復合物，占儲存蛋白的30%左右，作為大豆蛋白的一種新組分，自2007年提出以來，大豆親脂性蛋白一直備受關注[1]。

目前，大豆親脂性蛋白主要圍繞其良好的表面活性，如乳化性和起泡性等展開研究，與11S和7S球蛋白相比，添加0.000 1%的SLP能使界面張力降低10 mN/m，且SLP乳液在高鹽高濃度條件下表現出一定的熱穩定性[2]。WANG等[3]研究認為SLP納米乳液是一種有前景的遞送體系，能在低鹽離子濃度下最大限度地提高遞送效率，如LI等[4]通過大豆親脂蛋白-甲基纖維素復合物封裝親水性維生素B12建立水包油包水(W/O/W)體系，使其在存儲期間能起到包埋營養素，而在消化過程起到緩釋作用；ZHONG等[5]也發現SLP納米顆粒是白藜蘆醇良好載體，在十二烷基硫酸鈉作用下SLP解離締合封裝的白藜蘆醇納米顆粒具有良好的抗氧化性和可消化性；本研究團隊前期也發現經超聲誘導SLP自組裝封裝姜黃素形成的納米顆粒具有良好的抗氧化性[6]。然而因為SLP磷脂含量高、表面疏水性強以及自身緊湊的結構溶解度大大降低，限制了乳化性等其他功能特性的發揮，進而制約SLP的開發應用。

自組裝是基礎粒子由無序到有序轉變的過程，是一種制備具有吸引特性新粒子的“自下而上”的一種新技術[7-8]。研究顯示蛋白可以在不同pH-偏移誘導條件下形成具有不同結構性質的聚集物，且具有雙親性的蛋白在等電點附近通過自組裝可以形成具有特殊功能性質的球形聚集物，如菠蘿蛋白酶在其等電點附近誘導能形成具有特殊功能的熔球態結構蛋白[9]；β-乳球蛋白在等電點附近(pI 4.6～5.8)自組裝形成以球形聚集體為主體的穩定微凝膠[10]，這有助于其在食品領域中的應用，因此如何穩定形成的球形顆粒則是當前研究重點關注的問題。前期，本研究團隊研究了熱誘導條件下SLP解離締合行為，發現在90 ℃條件下SLP能形成均一穩定的納米體系[11]。然而，目前關于pH偏移誘導SLP解離締合行為及自組裝納米顆粒表征的研究鮮有報道。

本研究以SLP為研究對象，通過不同pH偏移誘導SLP自組裝形成納米顆粒，利用傅里葉紅外光譜(Fourier infrared spectroscopy，FTIR)、紫外光譜(ultraviolet spectroscopy，UV)、熒光光譜(fluorescence spectroscopy，FS)和圓二色譜(circular dichroism，CD)表征不同pH偏移誘導解離締合對SLP結構的影響；采用差示掃描量熱分析(differential scanning calorimetry，DSC)表征不同pH體系誘導對SLP結構穩定性的影響；通過柔性和乳化性評估不同pH偏移誘導解離締合行為對SLP功能性的影響；以期為SLP在食品領域進一步開發應用提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大豆親脂蛋白，自制；一級大豆色拉油，九三糧油工業集團有限公司。聚丙烯酰胺凝膠電泳套裝、溴化鉀(光譜純)，北京索萊寶生物科技有限公司；其余試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

J-815圓二色譜，英國應用光物理公司；紫外光譜儀、傅里葉紅外光譜儀、DSC-4000差示量熱掃描儀，美國珀金埃爾股份有限公司；F-4600型熒光光譜儀，日本日立儀器(上海)有限公司；Nano-ZS-90型馬爾文激光粒度儀，英國馬爾文儀器有限公司。ALPHA 1-2 LD plus型冷凍干燥機，德國Christ公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 pH偏移誘導處理

用濃度為10 mmol/L、pH為1.0～7.0的磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline，PBS)將SLP配制成蛋白濃度為10 mg/mL的溶液，在室溫條件(25±2) ℃下分別誘導0.5、1.0、2.0、4.0、8.0、12.0、24.0 h；誘導結束后pH調回中性(pH 7)，儲藏于4 ℃備用。

1.3.2 乳化性

將15 mL質量濃度為5 mg/mL的SLP溶液和5 mL大豆油加入到50 mL的EP管中，在10 000 r/min條件下均質2 min，用移液器從EP管底部吸取50 μL乳液于5 mL濃度為1 g/L、pH為7.0的SDS溶液中，充分混合后在500 nm波長下測吸光值。乳化性計算如公式(1)(2)所示[12]：

(1)

(2)

式中：EAI，乳化活性指數，m2/g；ESI，乳化穩定指數，min；N，稀釋倍數，100；c，蛋白質濃度，g/mL；Φ，光程，0.01 m；θ，油相體積分數，0.25；A0、A10分別為0和10 min的吸光值。

1.3.3 柔性測定

在4 mL質量濃度為1 mg/mL樣品液中按體積比16∶1加入濃度為0.05 mol/L，pH 7.0的Tris-HCl胰蛋白酶液(250 U/mg)，37 ℃反應5 min，用4 mL濃度為50 g/L的三氯乙酸終止反應，8 000 r/min離心10 min，取上清液在280 nm波長下測吸光值作為柔性指標[13]。

1.3.4 差示掃描量熱分析

精確稱取2.000 mg樣品密封于50 μL鋁制液體皿中，以升溫速率10 ℃/min，在20～120 ℃內利用DSC-4000差示量熱掃描儀測定樣品的熱流曲線，以空的密封鋁液體坩堝作為參比，試驗數據分析采用Pyris Software DSC 4000通用分析軟件進行。

1.3.5 粒徑測定

將樣品用pH 7.2的PBS稀釋成質量濃度1 mg/mL的溶液，并經0.45 μm水系醋酸纖維素濾膜過濾，設定蛋白折光率為1.145，吸光值為0.001，在25 ℃條件下平衡3 min，通過馬爾文激光粒度儀測定樣品的粒徑分布曲線。

1.3.6 紫外光譜測定

取質量濃度為0.1 mg/mL的樣品，設定分辨率為0.2 nm，掃描速率為600 nm/min，通過紫外光譜儀獲取190～800 nm原始蛋白紫外光譜，利用origin微分變換獲得二階導數紫外光譜。

1.3.7 內源熒光光譜測定

將樣品液用pH 7.2的PBS稀釋為質量濃度為0.1 mg/mL的溶液，在激發和發射狹縫均為5 nm、電壓為500 V條件下，以激發波長295 nm，300～400 nm波長掃描得到熒光光譜，掃描3次取平均值最后得到內源熒光光譜圖。

1.3.8 外源熒光光譜測定

將20 μL濃度為8 mmol/L的熒光探針(1-苯胺基-8-萘磺酸，ANS)加入到4 mL濃度為0.1 mg/mL的樣品中，避光靜置3 min后，設定狹縫為5 nm、激發波長390 nm，通過F-4600型熒光光譜儀掃描400～600 nm熒光發射光譜。

1.3.9 傅里葉紅外光譜測定

精確稱取2 mg樣品，按質量比1∶100加入KBr粉末，經充分研磨混合均勻后壓片成型，采用傅里葉紅外光譜儀在分辨率4 cm-1，掃描次數32條件下掃描4 000～400 cm-1的紅外光譜，經基線校準后，采用Peakfit 4.0.2計算酰胺I帶(1 700～1 600 cm-1)獲取蛋白二級結構信息。

1.3.10 圓二色譜的測定

用濃度為0.01 mol/L，pH為7.0的PBS將樣品稀釋至質量濃度為0.2 mg/mL的溶液，以相應磷酸鹽緩沖液為對照，在光徑10 mm，掃描頻率為90 nm/min，間隔時間0.25 s條件下采用ChirascanqCD圓二色譜獲取190～260 nm的遠紫外圓二色譜。

1.4 數據與分析

數據采用Excel 2013和SPSS 22.0進行分析(LSD，P<0.05)和處理，實驗均重復3次，數據以平均值±標準偏差表示。

2 結果與分析

2.1 pH偏移誘導對SLP結構影響分析

2.1.1 三級構象分析

由于一階紫外光譜難以辨別蛋白微環境變化后各個芳香族氨基酸的貢獻率，故使用紫外二級導數光譜辨別不同微環境條件下芳香族氨基酸暴露程度從而監測蛋白構象的變化[14]。pH偏移誘導SLP的二階紫外導數光譜如圖1-a所示。在280～300 nm存在2個正吸收峰(288和296 nm)和2個負吸收峰(283和291 nm)，據文獻報道，采用波峰和波谷距離“a”與“b”的比值“r”以及藍移程度來判斷pH偏移誘導后酪氨酸在SLP三級構象改變的貢獻，r值越大表示酪氨酸和色氨酸暴露程度越大，即蛋白三級構象越松散[15]。

a-二階導數光譜；b-二階導數光譜的r值圖1 pH偏移誘導對SLP二階導數紫外光譜影響Fig.1 Effects of pH-shift induction on the second-derivative UV spectra of SLP

由圖1-b可知，pH偏移誘導引起SLP的r值均大于天然狀態的r值，且在誘導8～10 h后其r值趨于相對穩定狀態，SLP酪氨酸和色氨酸暴露程度達到動態平衡，蛋白三級構象伸展趨于動態穩定。在0.5～8 h內r值變化規律不是很明顯，可能是SLP非單一組分，且含有較高含量的磷脂成分，在初始偏移誘導處理階段蛋白構象轉換、蛋白質-溶劑熱力學系統未達到平衡狀態，因而r值變化相對無序[16]。這與周向軍等[17]在蠶豆分離蛋白pH偏移過程中研究結果相一致。

圖2-a為pH偏移誘導對SLP內源熒光光譜的影響，結果顯示pH偏移誘導增加了SLP的內源熒光強度，且隨著pH的減小伴隨微小的藍移，表明pH偏移誘導使得SLP表面分布更多的疏水性氨基酸，并在偏移處理8～10 h后SLP的內源熒光強度趨于相對穩定狀態(圖2-b)。

a-pH偏移誘導10 h時SLP的內源熒光光譜圖； b-pH偏移誘導過程中SLP的最大內源熒光吸收值圖2 pH偏移誘導對SLP內源熒光光譜的影響Fig.2 Effects of pH-shift induction on the intrinsic fluorescence spectra of SLP

外源熒光結果如圖3-a所示，天然SLP具有最小的外源熒光強度和最大的λmax，隨著pH的減小和誘導時間的增加，SLP外源熒光強度呈增加并趨于穩定趨勢且伴隨一定程度的藍移；在誘導8～10 h后SLP外源熒光強度變化達到相對穩定狀態(圖3-b)，表明大部分酪氨酸和色氨酸殘基暴露于蛋白分子表面，蛋白三級構象變得更加松散。研究顯示，在pH偏移誘導過程中蛋白主要發生以下3個主要反應：(1)蛋白大分子解聚而降低分子質量；(2)谷氨酸殘基和精氨酸殘基脫氨反應；(3)部分氨基酸降解。這些反應都增加了蛋白分子中羰基含量并影響疏水相互作用和靜電引力，進而達到pH偏移誘導改變蛋白構象，最終使得埋藏于蛋白球形結構核心內部的疏水基團暴露于分子表面，因而使得表面疏水性增大[18]。這為調控和構造不同結構的SLP-多酚復合物及其應用提供了基礎[19]。

a-pH偏移誘導10 h時SLP的外源熒光光譜圖； b-pH偏移誘導過程中SLP的最大外源熒光吸收值圖3 pH偏移誘導對SLP外源熒光光譜的影響Fig.3 Effects of pH-shift induction on the extrinsic fluorescence spectra of SLP

2.1.2 二級構象分析

pH偏移誘導SLP的FTIR透射圖譜、酰胺I帶吸光圖譜、Gauss曲線擬合圖譜(以pH 7為例)、酰胺I帶二階導數吸光圖譜和二級結構含量變化如圖4所示。

a-紅外透射光譜圖；b-紅外酰胺I帶吸光圖譜；c-pH 7偏移誘導10 h時SLP的Gauss曲線擬合圖譜； d-紅外酰胺I帶二階導數光譜；e-二級結構含量；f-圓二色譜圖圖4 pH偏移誘導10 h時對SLP傅里葉紅外光譜和圓二色譜的影響Fig.4 Effects of pH-shift induction on the FTIR and CD spectra of SLP

由圖4-e可知，由于pH 5偏移誘導處理最接近SLP等電點(pI 5.2)，在該條件下的SLP分子間靜電斥力減弱引起分子間聚集大幅度增加(18.15%)以及形成相對結構緊密的蛋白構象。天然SLP二級結構的α-螺旋主吸收振動峰在1 653 cm-1，隨著pH偏移誘導pH值的減小(pH 7降至1)，酰胺I帶的二階導數圖譜顯示α-螺旋特征峰在1 653 cm-1吸收強度呈減弱趨勢，β-折疊特征峰1 612、1 623、1 638 cm-1逐漸增強；其中1 638、1 612 cm-1代表分子間和分子內聚集程度反向平行β-折疊結構的吸收強度呈下降趨勢，分別由15.16%降至9.98%和5.71%將至3.98%。通過對酰胺I帶進行Gauss多峰擬合求得SLP具體二級結構含量，發現α-螺旋相對含量由19.62%降低至12.67%；同時伴隨著β-折疊含量呈逐漸增加趨勢，其相對含量由34.06%增加至52.14%；與JIANG等[20]采用極端酸pH偏移誘導處理大豆蛋白發現α-螺旋含量減小而β-折疊含量增加結果相似。

進一步通過圓二色譜解析pH偏移誘導對SLP二級構象的影響(圖4-f)，CD圖譜中208 nm處為α-螺旋特征峰、216 nm處為β-折疊特征峰，在pH 5偏移誘導處理的SLP圓二譜圖性狀和肩峰位置與天然態相比發生明顯變化，該結果與紅外表征結果相一致(圖4-d)，可能是由于接近SLP等電點(pI 5.2)，SLP之間靜電斥力減弱、分子內氫鍵被破壞同時疏水相互作用增加導致分子間聚集程度增大，而隨著pH偏移的減小，pH偏移誘導SLP的CD在208和222 nm處肩峰吸收強度下降但峰型和位置沒有發生明顯變化，表明pH偏移誘導在一定程度上降低了SLP的α-螺旋結構含量而增加了β-折疊結構含量，該結果與FTIR的Gauss多峰擬合結果一致(圖4-e)。這是因為隨著偏移誘導pH的減小，游離的氫離子含量增加，大量的氫離子作用于SLP表面正電荷密度增強，使得蛋白表面親水性側鏈發生明顯變化而引起蛋白結構伸展并暴露出疏水性殘基，最終導致維系蛋白二級結構的氫鍵作用力被破壞，引起α-螺旋結構解旋進而暴露出更多的β-折疊及無規則卷曲結構[21]。研究發現在蛋白等電點附近誘導偏移處理同樣能獲得基本保持天然二級結構而三級結構松散的類似熔球態蛋白結構，如菠蘿蛋白酶在等電點附近(pH 10)誘導4 h后能獲得內源熒光和外源熒光強度增強并保持大量二級結構的特殊熔球態蛋白結構[9,22]。

2.1.3 熱穩定性分析

pH偏移誘導對SLP構象熱穩定性影響如圖5所示，pH偏移誘導(10 h)后的SLP均顯示出7S和11S球蛋白典型熱吸收峰，SLP焓值和變性溫度隨著偏移誘導pH的減小呈現出先增大后降低的趨勢，并在SLP等電點附近出現最大的變性溫度和焓值，MOLINA等[23]和RENKEMA等[24]研究也顯示向日葵和大豆的11S球蛋白在等電點附近變性溫度和焓值達到最大值。在低pH偏移誘導條件下(pH 由5降到1)SLP的11S球蛋白變性峰溫度由最大值97.27 ℃降至87.29 ℃、7S球蛋白變性峰溫度由最大值76.77 ℃降至64.57 ℃，同時總焓值由最大值4.87 J/g減少至0.34 J/g，且均小于天然態；表明低pH偏移誘導引起11S球蛋白和7S球蛋白的六聚體和三聚體解聚，而蛋白分子部分展開和蛋白結構內部分子斥力增強造成SLP蛋白分子熱穩定性下降；這與上文光譜解析pH偏移誘導對SLP蛋白構象影響結果一致。

a-熱流曲線圖；b-變性溫度和總焓值圖5 pH偏移誘導10 h時對SLP熱穩定性影響Fig.5 Effects of pH-shift induction on thermal stability of SLP

2.2 pH偏移誘導對SLP自組裝納米顆粒尺寸的影響

如圖6所示，天然態SLP呈多峰分布，在10 000 nm附近有較大的分布；隨著偏移誘導pH的減小，SLP流體動力學半徑先增大后減小，并伴隨著多分散系數下降，SLP粒徑逐漸趨于單分布；在pH 4條件下誘導偏移處理的SLP顆粒呈窄的單峰分布且具有最大的流體動力學半徑，表明在酸性環境誘導條件下，SLP分子結構內質子化程度增大，分子內部斥力增強，引起SLP緊湊的結構向無序狀態展開，并在進一步的pH偏移誘導過程中SLP納米顆粒發生自組裝，形成形狀較規則的球體納米顆粒，其分子形態由無序聚集狀態向粒徑分布均勻、尺寸均一、形狀規整的球形納米顆粒轉變，如圖7所示。然而在pH 1和2 條件誘導處理的SLP流體動力學半徑比天然態SLP要小，并伴隨著在10 nm左右處的顆粒分布增多的現象，這是因為在極端酸性條件下，SLP分子中的11S六聚體和7S三聚體逐漸解聚引起SLP整體分子流體動力學半徑減小。

a-SLP的粒徑分布圖；b-SLP的粒徑圖；c-SLP的圖圖6 pH偏移誘導10 h時對SLP粒徑和多分散系數的影響Fig.6 Effects of pH-shift induction on the size and polydisperity index of SLP

圖7 pH偏移誘導SLP自組裝納米顆粒行為示意圖Fig.7 Idealized schematic self-assembly of SLP by pH-shift induction

2.3 pH偏移誘導對SLP納米顆粒微觀形態影響

由圖8可知，pH偏移誘導使SLP由無規則、大小不一、棱角分明且質地相對密實的塊片狀向納米尺度的球形顆粒轉變；因pH 5條件處最接近SLP等電點(pI 5.2)，SLP分子表面凈電荷最小、分子斥力減弱以及強烈的疏水相互作用使得SLP分子發生強烈的集聚效應而形成質地密實的顆粒。隨著偏移誘導pH的減小，SLP體系中球形顆粒逐漸增多，在pH 4條件形成的球形顆粒分布較為均勻，而在極端pH條件形成的球形顆粒相對集中且尺寸較小。SCHMITT等[10]研究發現在100 nm掃描電鏡下，在pH 4.6～7.0誘導的β-乳球蛋白納米顆粒中，等電點附近(5.0)形成的納米顆粒成團狀，而接近中性pH 5.8～7.0 的β-乳球蛋白納米顆粒呈現線狀，pH也大，線狀越突出，但是在低于等電點附近的pH 4.6的蛋白納米顆粒呈現相對分布均勻的球形納米顆粒，這與本研究基本一致，其差異為本研究在pH 5.0～7.0呈現片狀和塊狀分布形貌，主要是由于本研究采用的掃描電鏡精度過低(放大倍數為100 μm)造成的。此外，周向軍等[17]在pH偏移結合溫和熱處理對蠶豆分離蛋白結構的影響中也發現類似的實驗現象。

a-pH 1；b-pH 2；c-pH 3；d-pH 4；e-pH 5；f-pH 6；g-pH 7圖8 不同pH偏移誘導10 h對SLP自組裝納米顆粒 微觀形貌的影響Fig.8 Effects of pH-shift induction on SLP self-assembly particles by SEM

2.4 pH偏移誘導對SLP乳化特性的影響

2.4.1 pH偏移誘導對SLP蛋白溶解性的影響

如圖9所示，pH 1誘導處理的SLP溶解度比天然的SLP大(45%)，可能是在極端酸性條件下SLP蛋白分子解聚形成小分子質量亞基從而提高溶解度；隨著pH偏移誘導pH由2增大到6，SLP溶解度逐漸減小，可能是pH偏移誘導處理使得SLP蛋白結構部分去折疊、結構伸展，更多的疏水性氨基酸殘基暴露于蛋白表面，引起SLP表面疏水性增強，并在溶液體系中通過疏水相互作用形成溶解度差的大分子聚集體，從而造成SLP蛋白溶解度下降，與其他學者[20,25-26]發現pH偏移誘導引起SPI溶解度降低結果相符。

圖9 pH偏移誘導(10 h)對SLP蛋白溶解特性的影響Fig.9 Effects of pH-shift induction (10 h) on the protein solubility of SLP注：不同小寫字母表示在P<0.05水平存在顯著性差異

2.4.2 pH偏移誘導對SLP柔性影響

如圖10所示，在等電點附近(pH 5)處理的SLP因處于凈電荷基本為零、由于分子間斥力降低而引起強烈的聚集效應形成緊湊的三級構象，從而導致SLP柔性最小；試驗結果顯示pH偏移誘導能使蛋白結構部分去折疊、結構展開從而有效降低SLP蛋白剛性結構，從而導致SLP柔性增強[13]。

圖10 pH偏移誘導(10 h)對SLP分子柔性的影響Fig.10 Effects of pH-shift induction (10 h) on the molecule flexibility of SLP

2.4.3 pH偏移誘導對SLP乳化特性的影響

由圖11可知，在pH 5條件下誘導的SLP由于凈電荷接近零，分子間斥力降低而引起強烈的聚集效應形成大量難溶性大分子聚集物，降低溶解度，并使SLP構象密實剛性增強而柔性降低。與天然SLP相比，pH偏移誘導處理提高了SLP乳化活性和乳化穩定性；這可能歸功于：pH偏移誘導處理使得蛋白結構部分去折疊、結構伸展，蛋白結構剛性下降而柔性增加，更有利于蛋白分子迅速吸附在油水界面膜上；而且結構伸展后暴露出更多疏水性氨基酸，使得蛋白表面疏水性增強從而提高了SLP表面活性，這與紫外光譜和熒光光譜分析結果相一致；而且SLP構象伸展以及解聚后暴露出埋藏于內部的磷脂和oleosin進一步提高了SLP的乳化功能特性。其他學者[20,25-26]也發現大豆分離蛋白和黑蕓豆分離蛋白經pH偏移誘導處理能提高其乳化功能特性。

圖11 pH偏移誘導(10 h)對SLP乳化特性的影響Fig.11 Effects of pH-shift induction (10 h) on the emulsibility of SLP

此外，在pH 4偏移誘導處理的SLP乳化功能特性表現突出，除了上述原因外，還可能與pH偏移誘導過程中SLP納米顆粒發生自組裝，形成形狀較規則的球體納米顆粒，其分子形態由無序聚集狀態向粒徑分布均勻、尺寸均一、形狀規整的球形納米顆粒轉變有關，因為顆粒均一的蛋白分子能迅速吸附，并形成穩定的油水界面膜從而提高乳化活性和乳化穩定性[27]；且研究表明，在等電點附近誘導處理的蛋白具有較大電荷補丁和良好吸附能力的多孔納米材料[22, 28]。

3 結論與討論

本實驗聯合多光譜、熱分析和動態光散射等技術，研究了pH偏移誘導SLP解離締合行為并對其自組裝納米顆粒進行表征，通過觀察不同pH條件下(pH 1～6)SLP蛋白三級構象的影響，詳細分析了pH偏移誘導10 h對SLP蛋白構象、流體動力學半徑、熱穩定性和乳化特性的影響。實驗結果表明，通過熒光光譜和紫外二階導數光譜分析發現pH偏移誘導使得SLP蛋白結構經歷去折疊、單帶亞基解離以及再聚集過程，大約10 h后SLP構象趨于穩定狀態，最終使得pH偏移誘導后的SLP蛋白表面分布更多的酪氨酸和色氨酸并且具有松散三維構象。SLP經pH偏移誘導10 h后，蛋白表面親水性側鏈發生明顯變化而最終導致維系蛋白二級結構的氫鍵作用力被破壞，引起α-螺旋結構解旋，含量下降，而β-折疊含量增加；同時DSC結果顯示在等電點處SLP具有最大的抗變性能力，而pH偏移誘導能誘發SLP聚集體解聚、蛋白結構伸展而引起熱穩定性下降。pH偏移誘導過程中SLP納米顆粒發生自組裝，形成形狀較規則和尺寸均一的球體納米顆粒，其分子形態由無序聚集狀態向粒徑分布均勻狀態轉變，在pH 4條件下誘導偏移處理的SLP顆粒呈較窄的正態分布且具有最大的流體動力學半徑，并呈現出良好的分子柔性和乳化特性。