卵裂期冷凍與囊胚期冷凍的單囊胚移植臨床結(jié)局比較

畢鋇鋇，付琬婷，代瑋，石森林，史昊，胡琳莉

(鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心，鄭州 450052)

隨著胚胎凍存技術(shù)的發(fā)展，凍融胚胎移植(FET)在輔助生殖技術(shù)(ART)中的應(yīng)用越來(lái)越廣泛。玻璃化冷凍作為ART中更有效和安全的胚胎凍存方式，應(yīng)用于卵裂期和囊胚期的胚胎凍存，均能獲得理想的實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)和臨床結(jié)局[1]。隨著生育政策的調(diào)整，不孕夫婦二胎的需求逐漸增加，對(duì)于新鮮周期獲卵數(shù)較多的夫婦，其二胎凍融周期可供選擇的移植策略包括凍融卵裂期胚胎移植、凍融卵裂期胚胎后囊胚培養(yǎng)移植和凍融囊胚移植。與卵裂期胚胎相比，囊胚的種植率更高，單囊胚移植不僅提高了妊娠率，而且降低了雙胎或多胎妊娠的風(fēng)險(xiǎn)，更好地保證了母嬰安全[2]。一些研究比較了卵裂期胚胎解凍復(fù)蘇后行囊胚培養(yǎng)后移植與凍融單囊胚移植的臨床結(jié)局，結(jié)果顯示凍融卵裂期胚胎后囊胚培養(yǎng)移植有更高的著床率、臨床妊娠率和活產(chǎn)率[3-5]，但這些研究均未關(guān)注其來(lái)源胚胎的等級(jí)和養(yǎng)成囊胚的等級(jí)。由于不同形態(tài)學(xué)等級(jí)的卵裂期胚胎囊胚培養(yǎng)的形成率不同[6]，移植不同等級(jí)的囊胚臨床結(jié)局也不同[7-8]。本研究旨在比較優(yōu)質(zhì)卵裂期胚胎解凍復(fù)蘇后行囊胚培養(yǎng)移植與常規(guī)凍融單囊胚移植的實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)及臨床結(jié)局，為臨床冷凍移植策略提供更多的選擇。

資料和方法

一、研究對(duì)象

回顧性分析2017年1月至2020年12月在鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心行卵裂期胚胎解凍復(fù)蘇后囊胚培養(yǎng)再移植患者及凍融單囊胚移植患者的臨床資料。

納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)D3胚胎形態(tài)學(xué)評(píng)級(jí)為Ⅱ級(jí)及以上優(yōu)質(zhì)胚胎的移植周期；(2)行單囊胚移植。

排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)孕婦年齡≥40歲；(2)女方供卵、胚胎植入前遺傳學(xué)診斷(PGD)、反復(fù)流產(chǎn)、染色體異常；(3)合并子宮疾?。鹤訉m畸形、宮頸功能不全、宮腔粘連、子宮內(nèi)膜異位癥；(4)低擴(kuò)張囊胚(≤2BB)；(5)Ⅲ級(jí)及以下評(píng)分的卵裂期胚胎；(6)玻璃化冷凍2次及以上的胚胎。

本研究共納入957例患者，每例患者均只有一個(gè)周期被納入研究。根據(jù)胚胎的冷凍時(shí)機(jī)，分為卵裂期冷凍組(112例)和囊胚期冷凍組(845例)。通過(guò)傾向性評(píng)分匹配對(duì)兩組患者進(jìn)行1∶1匹配，匹配變量包括孕婦的年齡、不孕年限、不孕癥類型、受精方式、基礎(chǔ)抗苗勒管激素(AMH)水平和囊胚質(zhì)量，匹配后產(chǎn)生卵裂期冷凍組(n=79)和囊胚期冷凍組(n=79)。

二、研究方法

1.囊胚培養(yǎng)及評(píng)分：胚胎質(zhì)量通常使用靜態(tài)形態(tài)學(xué)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評(píng)估。所有卵裂期胚胎都在第3天進(jìn)行分級(jí)，基于細(xì)胞數(shù)量、密度和碎裂程度，優(yōu)質(zhì)卵裂胚胎(Ⅰ級(jí)或Ⅱ級(jí))指第3天細(xì)胞數(shù)超過(guò)6個(gè)、破碎率<20%、細(xì)胞對(duì)稱(細(xì)胞大小相同)、無(wú)多核[9-11]。囊胚根據(jù)Gardner標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分級(jí)，分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)基于囊胚的擴(kuò)張、內(nèi)細(xì)胞團(tuán)(ICM)的發(fā)育和滋養(yǎng)外胚層(TE)的外觀[7，9]。可移植囊胚是指D5或D6的囊胚，內(nèi)細(xì)胞團(tuán)(ICM)或滋養(yǎng)外胚層(TE)至少有一項(xiàng)評(píng)分B；根據(jù)囊腔擴(kuò)張程度、ICM和TE，將評(píng)分3BB及以上(AA/AB/BA/BB級(jí))定義為優(yōu)質(zhì)囊胚。

2.囊胚的冷凍復(fù)蘇、內(nèi)膜準(zhǔn)備及囊胚移植：玻璃化冷凍和解凍復(fù)蘇方案以及子宮內(nèi)膜準(zhǔn)備均按照本中心的常規(guī)操作流程[12]。

3.觀察指標(biāo)：兩組患者的基本資料，包括年齡、BMI、不孕年限、不孕類型、受精方式、AMH水平以及基礎(chǔ)FSH；實(shí)驗(yàn)室胚胎發(fā)育指標(biāo)，包括內(nèi)膜準(zhǔn)備方案、囊胚形成情況、移植胚胎時(shí)機(jī)以及著床率；臨床妊娠結(jié)局，包括臨床妊娠率、流產(chǎn)率、異位妊娠率及活產(chǎn)率。囊胚形成率=可移植囊胚數(shù)/行囊胚培養(yǎng)的總優(yōu)質(zhì)卵裂期胚胎數(shù)×100%；優(yōu)質(zhì)囊胚形成率=優(yōu)質(zhì)囊胚數(shù)/可移植囊胚數(shù)×100%；著床率=孕囊數(shù)/移植胚胎數(shù)×100%；臨床妊娠率=臨床妊娠周期數(shù)/移植周期數(shù)×100%；流產(chǎn)率=流產(chǎn)周期數(shù)/移植周期數(shù)×100%；異位妊娠率=異位妊娠周期數(shù)/移植周期數(shù)×100%；活產(chǎn)率=活產(chǎn)周期數(shù)/移植周期數(shù)×100%；多胎妊娠率=多胎妊娠周期數(shù)/移植周期數(shù)×100%。本研究中流產(chǎn)率、異位妊娠率、多胎率的計(jì)算均以平均每移植周期的比率來(lái)表示。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、兩組患者囊胚形成情況

實(shí)驗(yàn)室結(jié)果顯示，卵裂期冷凍組的囊胚形成率與囊胚期冷凍組比較無(wú)顯著差異(P>0.05)；卵裂期冷凍組的D5囊胚形成率(62.8% vs.69.3%)、優(yōu)質(zhì)囊胚形成率(31.6% vs.49.9%)均顯著低于囊胚期冷凍組(P<0.05)；卵裂期冷凍組的D6囊胚形成率顯著高于囊胚期冷凍組(37.2% vs.30.7%，P<0.05)。

表1 兩組患者囊胚形成情況比較(%)

二、兩組患者基本資料

匹配前卵裂期冷凍組患者的平均年齡、不孕年限、繼發(fā)不孕占比均顯著高于囊胚期冷凍組(P<0.05)，而IVF的占比、AMH水平、優(yōu)質(zhì)囊胚占比顯著低于囊胚期冷凍組(P<0.05)；兩組的體質(zhì)量指數(shù)(BMI)、基礎(chǔ)促卵泡生成素(bFSH)、移植囊胚發(fā)育天數(shù)以及子宮內(nèi)膜準(zhǔn)備方案的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(表2)。

表2 兩組患者匹配前基本情況比較

經(jīng)PSM匹配和SMD平衡評(píng)估后，兩組患者均為79例，且兩組間有差異的基線資料，包括平均年齡、不孕年限、不孕類型、受精方式、基礎(chǔ)AMH水平、移植囊胚評(píng)分均得到平衡(SMD絕對(duì)值<0.1)；匹配后兩組間的全部基線資料均無(wú)顯著性差異(P>0.05)(表3)。

表3 兩組患者匹配后基本情況比較

三、兩組患者妊娠結(jié)局比較

匹配前，兩組患者的臨床妊娠率、著床率、活產(chǎn)率、異位妊娠率、流產(chǎn)率、多胎率均無(wú)顯著性差異(P>0.05)(表4)。然而，當(dāng)進(jìn)行PSM匹配后，與囊胚期冷凍組相比，卵裂期冷凍組的活產(chǎn)率顯著升高、流產(chǎn)率顯著下降(P<0.05)；兩組患者的臨床妊娠率、著床率、異位妊娠率、多胎率比較仍均無(wú)顯著性差異(P>0.05)(表5)。

表4 兩組患者匹配前妊娠結(jié)局的比較(%)

表5 兩組患者匹配后妊娠結(jié)局的比較(%)

討 論

隨著ART和胚胎凍存技術(shù)的發(fā)展，各中心凍存的卵裂期胚胎逐年增多；在適應(yīng)生育政策的調(diào)整下，不孕夫婦的二胎甚至三胎的需求也逐漸增多。凍融周期對(duì)凍存的卵裂期胚胎的利用也成為臨床醫(yī)生在臨床策略決定中重要的部分。本中心對(duì)于新鮮周期獲得多個(gè)卵裂期胚胎的患者，常規(guī)冷凍策略是將大多數(shù)卵裂期胚胎(優(yōu)質(zhì)和劣質(zhì))行囊胚培養(yǎng)后冷凍，同時(shí)留下少量?jī)?yōu)質(zhì)卵裂期胚胎直接冷凍。冷凍的可移植囊胚和優(yōu)質(zhì)卵裂期胚胎用于后續(xù)的凍融周期。當(dāng)患者存在子宮疤痕且僅剩冷凍的卵裂期胚胎時(shí)，后續(xù)凍融周期會(huì)選擇同時(shí)解凍復(fù)蘇多個(gè)卵裂期胚胎行囊胚培養(yǎng)后進(jìn)行單囊胚移植。比較解凍復(fù)蘇的卵裂期胚胎行囊胚培養(yǎng)移植與常規(guī)凍融單囊胚移植在實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)和臨床結(jié)局上的差異是本研究的目的。

在本研究中，所有的胚胎都是采用玻璃化冷凍方法保存的。與傳統(tǒng)的慢速冷凍方法相比[16]，胚胎玻璃化冷凍作為一種超快速冷凍保存方法，能夠避免細(xì)胞凍存時(shí)生成的結(jié)晶對(duì)細(xì)胞的損傷[14，17]；無(wú)論凍存卵裂期胚胎還是囊胚期胚胎，玻璃化冷凍均能確保胚胎非常高的存活率[1]。動(dòng)物研究發(fā)現(xiàn)，新鮮卵裂期的小鼠胚胎和經(jīng)過(guò)玻璃化凍融的小鼠胚胎發(fā)育成的囊胚在基因表達(dá)上沒(méi)有顯著差異[18]。我們的臨床結(jié)果與上述研究相一致，解凍復(fù)蘇優(yōu)質(zhì)卵裂期胚胎行囊胚培養(yǎng)的囊胚形成率與新鮮周期的優(yōu)質(zhì)卵裂期胚胎行囊胚培養(yǎng)相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。盡管玻璃化冷凍是一種相對(duì)安全的冷凍方法，但冷凍保存對(duì)胚胎的毒性效應(yīng)不容忽視[14]。冷凍保護(hù)劑本身具有細(xì)胞毒性，并可能滲透或直接造成細(xì)胞損傷[19-20]。本研究的結(jié)果也進(jìn)一步體現(xiàn)出冷凍過(guò)程對(duì)胚胎的影響，解凍復(fù)蘇的優(yōu)質(zhì)卵裂期胚胎的D5囊胚形成率和優(yōu)質(zhì)囊胚形成率均低于未經(jīng)過(guò)冷凍的新鮮周期優(yōu)質(zhì)卵裂期胚胎。

為了保證臨床資料的有效及結(jié)果的可靠性，我們對(duì)納入的研究對(duì)象進(jìn)行了傾向性評(píng)分匹配，并對(duì)匹配前后基線資料的差異性進(jìn)行了SMD值的統(tǒng)計(jì)，匹配后的SMD值均小于0.1，使得兩組間的變量得到有效均衡。

囊胚的形態(tài)學(xué)評(píng)分在一定程度上與妊娠結(jié)局存在相關(guān)性[6-7，21]。本研究中匹配前囊胚期冷凍組更多的優(yōu)質(zhì)囊胚并沒(méi)有獲得更高的活產(chǎn)率，而匹配相同等級(jí)評(píng)分的囊胚后，囊胚期冷凍組的活產(chǎn)率卻顯著低于卵裂期冷凍組，這一結(jié)果與既往的研究相一致[4-5]。同時(shí)本研究卵裂期冷凍組的流產(chǎn)率更低。可能的原因?yàn)?，解凍?fù)蘇后的卵裂期胚胎發(fā)育為囊胚的過(guò)程，一定程度上對(duì)胚胎進(jìn)行了自然選擇，從而篩選出更具有發(fā)育潛能的胚胎，而這種選擇無(wú)法通過(guò)胚胎學(xué)家在形態(tài)學(xué)上的區(qū)分解釋。另一方面，胚胎發(fā)育的過(guò)程發(fā)生細(xì)胞周期及DNA損傷等的修復(fù)[22]，當(dāng)卵裂期胚胎發(fā)育為囊胚的過(guò)程發(fā)生于胚胎凍融程序之后，胚胎的發(fā)育則可能在一定程度上修復(fù)冷凍對(duì)胚胎產(chǎn)生的傷害[4，23]。國(guó)內(nèi)研究發(fā)現(xiàn)，解凍復(fù)蘇卵裂期胚胎培養(yǎng)至囊胚后移植與凍融卵裂期胚胎直接移植相比，減少了患者平均移植胚胎數(shù)且妊娠結(jié)局無(wú)顯著差異[24]，但該研究的移植胚胎處于不同的發(fā)育階段，且胚胎凍存使用慢速冷凍法可能增加對(duì)胚胎的傷害。

本研究也存在一些局限性，首先，胚胎和囊胚的分級(jí)是通過(guò)人為觀察進(jìn)行的。第3天卵裂期胚胎和囊胚的形態(tài)學(xué)判定是主觀的，臨床工作中不可避免地會(huì)出現(xiàn)差異[25]。然而，此種人為的差異在日常工作中會(huì)分布至每一位患者中，因此可以得到一定程度的均衡。其次，作為一項(xiàng)回顧性研究，回顧性數(shù)據(jù)的弊端不可避免，因此我們進(jìn)行了匹配以平衡誤差，但這種方法也會(huì)導(dǎo)致樣本量的減少。另外，本研究未統(tǒng)計(jì)兩組的累計(jì)臨床妊娠情況，不能反映整個(gè)周期的移植效果，未來(lái)需要更多的前瞻性研究以及累計(jì)妊娠結(jié)局的觀察，來(lái)綜合評(píng)價(jià)該策略的有效性，為不孕夫婦提供更高效的移植策略。

盡管解凍復(fù)蘇優(yōu)質(zhì)卵裂期胚胎后囊胚培養(yǎng)的臨床樣本尚少，本研究結(jié)果顯示，解凍復(fù)蘇后的優(yōu)質(zhì)卵裂期胚胎培養(yǎng)為囊胚的囊胚形成率不低于新鮮優(yōu)質(zhì)卵裂期胚胎，且臨床結(jié)局優(yōu)于凍融單囊胚移植，增加活產(chǎn)率的同時(shí)，降低了胚胎流產(chǎn)率，提高了種植效率。因此，對(duì)于凍存有優(yōu)質(zhì)卵裂期胚胎、子宮有疤痕的不孕夫婦，二胎或三胎的凍融周期選擇解凍復(fù)蘇優(yōu)質(zhì)卵裂期胚胎行囊胚培養(yǎng)是值得考慮的臨床策略之一。