GnRH-a聯(lián)合HCG雙扳機在高齡卵巢儲備功能減退患者中的應用

王金玉，張嘯龍，張杰平，王雪，張翠蓮

(鄭州大學人民醫(yī)院，河南省人民醫(yī)院，河南省生殖醫(yī)學工程國際聯(lián)合實驗室，鄭州 450003)

隨著社會發(fā)展及女性生育意愿推遲，高齡不孕癥女性逐年增加。高齡是引起卵巢儲備功能減退(DOR)的重要因素。高齡DOR患者因卵母細胞數(shù)量減少及質(zhì)量下降，在促排卵治療中常表現(xiàn)為卵母細胞質(zhì)量差、獲卵少、受精率下降，從而難以獲得理想的妊娠結局[1]。高齡DOR患者助孕治療的關鍵是提高卵母細胞質(zhì)量，以期獲得更多可利用胚胎。對于接受促排卵治療的患者，由于垂體受到抑制，臨床常通過注射人絨毛膜促性腺激素(HCG)，模擬體內(nèi)LH峰，以促進卵母細胞最終成熟，即HCG扳機方案。然而實際在自然生理周期中，觸發(fā)卵母細胞最終的成熟和排卵是由LH與FSH協(xié)同完成，研究顯示伴隨LH峰出現(xiàn)的FSH 峰可以促進卵泡成熟[2]。應用促性腺激素釋放激素激動劑(GnRH-a)聯(lián)合HCG扳機觸發(fā)排卵，與既往HCG扳機僅模擬LH峰不同，GnRH-a扳機不僅能誘發(fā)LH峰，還能誘發(fā)FSH峰，更接近生理狀態(tài)，如果GnRH-a聯(lián)合標準劑量的HCG扳機，則LH作用更強，同時還伴有內(nèi)源性FSH峰的出現(xiàn)，更有利于卵母細胞成熟[3]。近年來，越來越多的研究報道相較單純HCG扳機，采用GnRH-a聯(lián)合HCG扳機可以顯著提高DOR患者行體外受精/卵胞漿內(nèi)單精子顯微注射-胚胎移植(IVF/ICSI-ET)周期的獲卵數(shù)、MⅡ卵數(shù)、正常受精(2PN)數(shù)、第3天(D3)可利用胚胎數(shù)、臨床妊娠率，甚至活產(chǎn)率[4-7]。因年齡是臨床妊娠率的獨立影響因素[8]，所以有一項研究僅納入了年齡≥35歲DOR患者，其結果顯示GnRH-a聯(lián)合HCG扳機可改善患者IVF凍融胚胎移植周期的臨床結局[9]。目前鮮有關于GnRH-a聯(lián)合HCG扳機是否可以改善≥35歲DOR患者新鮮胚胎移植周期的臨床結局的研究報道[10]。本研究通過回顧性分析≥35歲高齡DOR患者行拮抗劑方案促排卵中使用GnRH-a聯(lián)合HCG扳機的應用效果，以期為改善高齡DOR患者新鮮胚胎移植周期妊娠結局提供更好的扳機方案。

資料和方法

一、研究對象

回顧性分析2016年1月至2021年10月在河南省人民醫(yī)院生殖醫(yī)學中心行IVF/ICSI-ET助孕的患者臨床資料。

納入標準：(1)本周期促排卵采用拮抗劑方案；(2)年齡≥35歲；(3)符合DOR診斷標準[11]，即月經(jīng)第3天(月經(jīng)紊亂者可于超聲檢查未見優(yōu)勢卵泡時)竇卵泡計數(shù)(AFC)<7個、抗苗勒管激素(AMH)≤1.1 ng/ml、基礎促卵泡生成素(bFSH)≥10 U/L，以上3項符合2項。

排除標準：(1)多囊卵巢綜合征患者；(2)存在宮腔疾病嚴重影響子宮內(nèi)膜環(huán)境，包括重度子宮內(nèi)膜異位癥、子宮內(nèi)膜增生或結核、宮腔積液或重度粘連等；(3)糖尿病、甲亢、高泌乳素血癥等內(nèi)分泌疾病者；(4)其中一方染色體異常。

研究共納入273個周期，根據(jù)扳機方式不同分為雙扳機組(GnRH-a聯(lián)合HCG扳機n=177)和HCG板機組(n=96)。

二、研究方法

1.促排卵方案：兩組患者均采用拮抗劑方案促排。月經(jīng)第2～4天行B超檢查和基礎性激素測定，如果沒有優(yōu)勢化卵泡和功能性卵巢囊腫，使用促性腺激素(Gn)(果納芬，默克雪蘭諾，瑞士；或普麗康，默沙東，美國；或麗申寶，珠海麗珠；或尿促卵泡素，珠海麗珠)150～300 U/d 至扳機日。于促排卵第4天再次B超監(jiān)測卵泡發(fā)育，待B超下見卵泡直徑≥12 mm時，加用促性腺激素釋放激素拮抗劑(GnRH-ant)(思則凱，默克雪蘭諾，美國)0.25 mg/d，皮下注射至扳機日。根據(jù)卵泡直徑、血清激素水平確定扳機時間，當有2個卵泡直徑≥17 mm或1個卵泡直徑≥18 mm 時，根據(jù)個體情況給予2種不同的扳機方案：(1)雙扳機方案：HCG(珠海麗珠)6 000～10 000 U肌肉注射聯(lián)合GnRH-a(達必佳，輝凌，德國)0.2 mg皮下注射；(2)HCG 扳機方案：HCG 6 000～10 000 U肌肉注射。兩組均于扳機后34～36 h取卵。

2.胚胎培養(yǎng)及移植：新鮮周期取卵后，根據(jù)男方精液參數(shù)進行IVF或ICSI受精。取卵后第3天(D3卵裂期胚胎)評估胚胎質(zhì)量，結合患者本周期整體情況和患者意愿，選取1～2枚D3可利用胚胎進行新鮮胚胎移植或胚胎玻璃化冷凍保存。

根據(jù)卵裂球的數(shù)目、大小、形態(tài)及碎片量將D3卵裂期胚胎分為Ⅳ級。Ⅰ級：卵裂球大小均勻，形態(tài)規(guī)則，透明帶完整，碎片<10%；Ⅱ級：卵裂球大小略不均勻，形態(tài)略不規(guī)則，10%≤碎片<25%；Ⅲ級：卵裂球大小不均，形態(tài)不規(guī)則，25%≤碎片≤50%；Ⅳ級：卵裂球大小嚴重不均，形態(tài)嚴重不規(guī)則，碎片>50%。優(yōu)質(zhì)胚胎評判標準：顯微鏡下觀察受精后D3胚胎卵裂球數(shù)為6～10個，且卵裂球大小均勻，碎片<25%。故Ⅰ、Ⅱ級為優(yōu)質(zhì)胚胎，Ⅲ級為有效胚胎，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ級胚胎為可利用胚胎。

3.黃體支持：行新鮮胚胎移植的患者于取卵日開始黃體支持，給予地屈孕酮片(達芙通，蘇威，荷蘭)10 mg/次口服，3次/d，聯(lián)合8%黃體酮陰道緩釋凝膠(雪諾同，默克雪蘭諾，德國)90 mg陰道給藥，1次/d。移植14 d后查血β-HCG判斷是否妊娠，若血β-HCG<0.1 U/L則為未妊娠，停用黃體支持藥物；若0.1 U/L<血HCG<50 U/L，則隔日復查HCG，繼續(xù)黃體支持，正常情況下繼續(xù)黃體支持至移植后70 d逐漸減量停藥。

4.妊娠結局的判定：根據(jù)血β-HCG水平明確妊娠情況，β-HCG≥50 U/L時則為HCG陽性。移植后28 d、35 d行B超檢查，B超下可見孕囊及胎心搏動為臨床妊娠。妊娠不足12周終止者為早期流產(chǎn)。

5.觀察指標：兩組患者的一般資料、HCG日E2水平及≥14 mm卵泡數(shù)、HCG扳機劑量、獲卵數(shù)、MⅡ卵數(shù)、MⅡ卵率、2PN數(shù)、2PN率、D3可用胚胎數(shù)、D3可用胚胎率、D3優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)、D3優(yōu)質(zhì)胚胎率、未取到卵母細胞率、無可移植胚胎率、著床率(著床率=孕囊數(shù)/移植胚胎數(shù)×100%)、HCG陽性率(HCG陽性率=HCG陽性周期數(shù)/新鮮胚胎移植周期數(shù)×100%)、臨床妊娠率(臨床妊娠率=臨床妊娠周期數(shù)/新鮮胚胎移植周期數(shù)×100%)、早期流產(chǎn)率(早期流產(chǎn)率=早期流產(chǎn)周期數(shù)/臨床妊娠周期數(shù)×100%)等。

三、統(tǒng)計學分析

結 果

一、兩組患者的一般資料

共納入符合條件的268例高齡DOR患者，共273個周期，雙扳機組(n=177)和HCG板機組(n=96)間的患者年齡、體質(zhì)量指數(shù)(BMI)、不孕年限、AMH、AFC、bFSH、Gn天數(shù)、Gn總用量、HCG日E2水平、HCG日≥14 mm卵泡數(shù)及HCG扳機劑量等比較均無顯著性差異(P>0.05)(表1)。

表1 兩組患者一般資料比較

二、兩組患者的促排卵情況

雙扳機組的MⅡ卵數(shù)、2PN數(shù)及D3可用胚胎數(shù)均顯著高于HCG扳機組(P<0.05)；無可移植胚胎率顯著低于HCG扳機組(P<0.05)；兩組患者的平均獲卵數(shù)、MⅡ卵率、2PN率、D3可用胚胎率、D3優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)、D3優(yōu)質(zhì)胚胎率、未取到卵母細胞率及ICSI比例均無顯著性差異(P>0.05)，但雙扳機組未取到卵母細胞率略低于HCG扳機組(表2)。

表2 兩組患者促排卵情況比較

三、兩組患者新鮮周期移植的妊娠結局

本研究中雙扳機組有74個周期、HCG扳機組有58個周期進行了新鮮周期移植。統(tǒng)計新鮮周期移植的臨床妊娠結局，結果顯示：雙扳機組的HCG陽性率、臨床妊娠率顯著高于HCG扳機組(P<0.05)；但兩組患者的移植胚胎數(shù)、移植日內(nèi)膜厚度、著床率及早期流產(chǎn)率比較均無顯著性差異(P>0.05)(表3)。

表3 兩組患者新鮮周期移植臨床結局比較

四、廣義估計方程分析臨床妊娠率的影響因素

將分組依據(jù)納入方程，同時納入年齡、不孕年限、AMH、AFC、HCG日≥14 mm卵泡數(shù)等作為協(xié)變量，選擇自相關來定義同一患者多個周期間數(shù)據(jù)的關系。結果顯示，控制自相關并校正混雜因素后，雙扳機方案的使用[OR=2.413，95%CI(1.016，5.728)，P=0.046]是臨床妊娠率的保護因素，年齡增加[OR=0.787，95%CI(0.694，0.893)，P<0.001]是臨床妊娠率的危險因素(表4)。

表4 廣義估計方程多因素分析結果

討 論

高齡DOR患者因卵巢AFC數(shù)減少，導致卵巢低反應，因此如何提高卵母細胞質(zhì)量并獲取更多可利用胚胎成為治療該類患者的研究熱點。GnRH-a+HCG雙扳機方案可在一定程度上提高DOR患者IVF/ICSI周期的卵母細胞質(zhì)量及胚胎質(zhì)量，進而改善臨床結局。Zhang等[6]回顧性隊列研究納入卵巢低反應患者共714個IVF-ET周期，但未限制年齡，其結果表示雙扳機組[平均年齡(36.31±4.37)歲]的獲卵數(shù)、獲卵率、MⅡ卵數(shù)及MⅡ卵率均顯著高于HCG扳機組[平均年齡(35.95±4.47)歲]，但凍融胚胎移植周期中兩組臨床妊娠率無顯著差異。眾所周知，年齡是影響卵母細胞數(shù)量及質(zhì)量的重要因素，也是臨床妊娠率的獨立影響因素[8]。Chern等[9]研究中納入了≥35歲的高齡DOR患者共384個IVF-ET周期，結果顯示雙扳機組的獲卵數(shù)、MⅡ卵數(shù)、2PN數(shù)、D3可用胚胎數(shù)和D3優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)均顯著高于HCG扳機組，在凍融胚胎移植周期中雙扳機組[平均年齡(40.0±2.7)歲]的臨床妊娠率和活產(chǎn)率也均顯著高于HCG扳機組[平均年齡(40.0±2.8)歲]。但Xiao[10]提出凍融胚胎移植周期妊娠結局的影響因素更多是胚胎質(zhì)量及子宮內(nèi)膜準備情況，扳機藥物的作用可能較小，并建議比較雙扳機組與HCG扳機組的新鮮胚胎移植周期妊娠結局。另外，有研究報道GnRH-ant促排卵周期注射HCG聯(lián)合GnRH-a扳機可以改善卵巢正常反應者新鮮胚胎移植周期的妊娠結局，他們推測GnRH-a與GnRH受體(GnRHR)的親和力比GnRH-ant強，GnRH-a可以從子宮內(nèi)膜的GnRHR中置換出GnRH-ant，從而激活之前被GnRH-ant抑制的GnRHR，繼而調(diào)控HCG分泌，建立“母胎對話”通路，改善子宮內(nèi)膜容受性，為胚胎著床創(chuàng)造有利條件[12-13]。因此本研究納入采用GnRH-ant方案促排卵且年齡≥35歲高齡DOR患者的IVF/ICSI-ET周期，旨在探索雙扳機方案能否提高此類患者的獲卵參數(shù)及改善新鮮胚胎移植周期妊娠結局。

本研究結果顯示，雙扳機組的MⅡ卵數(shù)、2PN數(shù)及D3可用胚胎數(shù)均顯著高于HCG扳機組，無可移植胚胎率顯著低于HCG扳機組，與既往Chern等[9]研究結果一致。且本研究表示雙扳機組新鮮胚胎移植周期的HCG陽性率和臨床妊娠率均顯著高于HCG扳機組。GEE校正了年齡、AMH、AFC等混雜因素的結果顯示，雙扳機方案的使用[OR=2.413，95%CI(1.016，5.728)，P=0.046]是臨床妊娠率的保護因素，年齡增加[OR=0.787，95%CI(0.694，0.893)，P<0.001]是臨床妊娠率的危險因素。上述研究結果提示雙扳機方案有利于改善高齡DOR患者卵母細胞質(zhì)量、受精情況，提高D3可利用胚胎數(shù)、降低無可移植胚胎率。

實際上在生理周期中，卵母細胞最終成熟就是在內(nèi)源性LH峰協(xié)同F(xiàn)SH峰的作用下完成的。一方面，LH峰可誘導卵母細胞減數(shù)分裂為次級卵母細胞，并促進相關促排卵物質(zhì)釋放，使卵丘和卵巢顆粒細胞分離，是卵母細胞成熟及排卵的必要條件[9]。盡管注射HCG可以模擬LH結合LH/HCG受體(LHCGR)，觸發(fā)卵母細胞成熟，但因HCG和LH與LHCGR的親和力和半衰期不同，HCG在部分情況下不能誘導卵母細胞減數(shù)分裂并完成卵母細胞生發(fā)泡破裂，最終導致部分卵母細胞不成熟，或者卵母細胞細胞質(zhì)與細胞核成熟度不同步，引起受精率降低，甚至無可用胚胎[5，14]。GnRH-a生物學特性是天然GnRH的50～100倍，GnRH-a可激發(fā)垂體的點火效應，誘發(fā)更加接近生理水平的LH峰[15]。雖然GnRH-a扳機觸發(fā)的內(nèi)源性LH峰的時間較短、峰值較低，但雙扳機方案中聯(lián)合標準劑量HCG扳機模擬LH峰可以彌補這一缺陷，因此雙扳機方案在LH峰方面的雙重作用有助于卵母細胞成熟，提高卵母細胞及胚胎質(zhì)量[12]。GnRH-a激活LHCGR能力較弱，會導致新鮮胚胎移植周期黃體功能不足，但雙扳機方案在GnRH-a誘發(fā)排卵同時添加標準劑量HCG可以補救黃體功能不足并改善新鮮胚胎移植周期妊娠結局[16]。另一方面，GnRH-a誘發(fā)的內(nèi)源性FSH峰在促進卵母細胞成熟及排卵中也發(fā)揮著重要作用。既往研究比較了雙扳機組與HCG扳機組卵巢顆粒細胞中相關基因的表達水平，包括與FSH水平直接相關的基因[表皮調(diào)節(jié)素(Ereg)、雙調(diào)蛋白(Areg)及通道蛋白43]，結果顯示FSH可以上調(diào)Ereg、Areg的mRNA表達，有助于提高人GV期卵母細胞的成熟率，介導FSH參與卵丘擴張和卵母細胞成熟[9，16-18]。雙扳機方案觸發(fā)的FSH峰還可以下調(diào)通道蛋白43的mRNA表達，有利于卵母細胞發(fā)育[16，19]。因此，雙扳機方案利用GnRH-a觸發(fā)內(nèi)源性FSH峰，既可增加顆粒細胞中Ereg、Areg的表達，又降低了通道蛋白43的表達，提高了卵母細胞及胚胎質(zhì)量[16]，本研究的實驗結果可能也與此相關。

綜上所述，在高齡DOR患者的拮抗劑方案促排卵周期中，GnRH-a聯(lián)合HCG扳機方案較單純HCG扳機方案可以顯著提高MⅡ卵數(shù)、2PN數(shù)、D3可用胚胎數(shù)及新鮮移植周期的臨床妊娠率，經(jīng)GEE校正年齡、AMH、AFC等混雜因素后，雙扳機方案仍是臨床妊娠率的保護因素。因此，在臨床中，對于高齡DOR患者可嘗試用GnRH-a聯(lián)合HCG的雙扳機方案，但由于本文為回顧性研究且樣本量較小，實驗結果尚需要更大樣本量的隨機對照研究加以證實。