影響不明原因不孕患者體外受精-胚胎移植妊娠結局的多因素分析

林琳，劉蕓，黃吳健，陳國勇

(福建醫科大學?？偱R床醫學院 聯勤保障部隊第九○○醫院生殖醫學中心，福州 320025)

隨著社會與環境因素的變化，人們的生活方式也發生了明顯改變，不孕人群的數量也越來越多。在不孕患者中有相當一部分的不明原因不孕(UI)，國外報道UI的發病率約8%～37%[1]。UI夫婦往往擁有正常的輸卵管、正常的精液參數、正常的排卵功能，卻缺乏可識別的不孕原因[2-4]。因診斷標準有分歧，UI相關的高水平的臨床研究并不多。本研究通過回顧性分析UI女性患者在體外受精(IVF)助孕過程中臨床特征，探討相關因素對UI患者妊娠結局的影響，為改善UI患者的妊娠結局提供科學依據。

資料與方法

一、研究對象

回顧性分析2019年1月-12月于第九○○醫院生殖中心首次行拮抗劑方案IVF/卵胞漿內單精子注射(ICSI)助孕的UI患者的臨床資料。

納入標準：(1)首次行拮抗劑方案治療；(2)經腹腔鏡檢查或者輸卵管造影證實至少有一側輸卵管通暢，并至少行3周期人工授精(IUI)未孕；(3)年齡<38歲；(4)月經規律，超聲證實有正常排卵；(5)基礎竇卵泡計數(AFC)>7個，抗苗勒管激素(AMH)>1.1 ng/ml；(6)男方精液未見明顯異常。

排除標準：(1)排卵障礙的患者，如多囊卵巢綜合征(PCOS)；(2)經腹腔鏡或者輸卵管造影提示存在盆腔因素，如盆腔子宮內膜異位癥、輸卵管梗阻或炎癥、盆腔結核、生殖道畸形等；(3)男方中重度少弱畸精子癥；(4)有自身免疫性疾病和遺傳病史；(5)合并存在影響IVF妊娠結局的相關疾病，如子宮腺肌癥、子宮肌瘤≥4 cm、未經治療的輸卵管積水、未經治療的子宮內膜病變等；(6)未經治療的內分泌疾病，如：甲狀腺功能亢進，高泌乳素血癥等；(7)夫妻雙方存在任何一方有染色體異常的情況。

本研究共納入UI患者147個周期(UI 組)，選擇同時段和同年齡段就診的輸卵管阻塞因素(包含輕度的男方因素)不孕患者 341個周期為對照組。

二、研究方法

1.促排卵前準備：月經期第2～4天靜脈采血檢查血清促卵泡生成素(FSH)、促黃體生成素(LH)、雌二醇(E2)、孕酮(P)及AMH水平，近排卵期開始陰道超聲監測卵泡發育至排卵，并記錄AFC，排卵后1周左右開始行雌激素預處理至月經第2天早晨。

2.拮抗劑方案促排卵：月經第2天開始每天注射促性腺激素(Gn)，起始劑量150～225 U/d，適時調整Gn劑量，至最大卵泡直徑達12～13 mm，和(或)E2水平超過1 468 pmol/L，和(或)LH>5 U/L時加用醋酸西曲瑞克(思則凱，默克雪蘭諾，瑞士)0.25 mg/d至HCG日。當主導卵泡直徑達18 mm時，當晚注射HCG(安徽豐原藥業)6 000～10 000 U。

3.取卵及受精：注射HCG后36～38 h，經陰道超聲引導下行穿刺取卵術。根據當天獲卵情況，優先選擇行IVF受精，受精后5～6 h，拆除部分顆粒細胞觀察受精情況，若超過1/3的卵母細胞無受精征象，則進行補救ICSI受精。

4.胚胎培養及移植：按照本生殖中心的常規操作進行胚胎培養和評估[5]。再根據患者自身情況，選擇取卵后第3天新鮮卵裂胚1～2枚移植或全胚冷凍。鮮胚移植及凍融胚胎移植(FET)后均按照本生殖中心常規行黃體支持治療。

5.妊娠判斷：胚胎移植14 d后測定血清β-HCG水平，若β-HCG>25 U/L，則確定為HCG陽性。移植后28 d行陰道B超檢查，見孕囊者確定為臨床妊娠，包括宮內妊娠和宮外妊娠。孕12周之前的胚胎丟失記為早期流產，孕12～28周的胚胎丟失記為中晚期流產。有胎兒活產(包括早產)者為活產周期?；町a主要通過電話隨訪登記，電話隨訪至2021年12月。

6.觀察指標：主要觀察指標為成熟卵率、受精率、可移植胚胎率、優質囊胚形成率、補救ICSI發生率、鮮胚移植臨床妊娠率、累積妊娠率及累積活產率。累積妊娠率=當次取卵周期后首次獲得妊娠的例數(包括鮮胚移植與FET周期)/取卵周期數×100%。累積活產率=當次取卵周期后首次獲得活產的例數(包括鮮胚移植與FET周期)/取卵周期數×100%。

三、統計學方法

結 果

一、兩組患者的基本資料比較

本研究共納入488個周期，包括147個UI周期患者和341個對照周期患者。兩組患者間的年齡、不孕年限、BMI、bFSH、bLH、bE2、AFC及AMH水平比較均無顯著差異(P>0.05)(表1)。

表1 兩組患者的基本資料比較

二、兩組患者的促排卵、胚胎發育及臨床結局情況

1.兩組患者的促排卵情況：分析結果顯示，兩組間的Gn用量、扳機日內膜厚度及激素水平和卵泡直徑大于14 mm 數目以及獲卵數等指標均無顯著性差異(P>0.05)；UI組的MⅡ卵率顯著低于對照組(P<0.05)(表2)。

表2 兩組患者的促排卵結果

2.受精及胚胎發育情況：統計結果顯示，與對照組相比，UI組的IVF受精率、囊胚及優質囊胚的形成率均顯著降低(P<0.05)；UI組補救ICSI發生率有增加趨勢，但差異尚無統計學意義(P>0.05)；兩組的受精率、2PN受精率、2PN卵裂率、可移植胚胎率及D3優胚率均無顯著性差異(P>0.05)(表3)。

表3 兩組患者的受精及胚胎發育情況比較(%)

3.妊娠結局比較：兩組的鮮胚移植臨床妊娠率無顯著性差異(P>0.05)；與對照組相比，UI組累積妊娠率顯著降低(P<0.05)，累積活產率有降低趨勢但尚無統計學差異(P>0.05)(表4)。UI組未獲得活產尚有冷凍胚胎周期數是5例，占3.40%(5/147)，對照組未獲得活產尚有冷凍胚胎周期數是15例，占4.40%(15/341)，兩組之間無統計學差異(P>0.05)。

表4 兩組患者的妊娠結局比較

三、影響UI患者妊娠結局的多因素Logistic回歸分析

以妊娠結局為因變量(臨床妊娠、活產賦值=1，無臨床妊娠、未活產=0)，將臨床認為與UI有關、單因素分析P<0.05的項目為自變量(年齡≤30歲=0，年齡>30歲=1)采用多因素Logistic回歸，逐步法排除無關項目。最終分析結果顯示：年齡是影響鮮胚移植臨床妊娠的危險因素(P<0.05)，年齡>30歲UI患者行鮮胚移植臨床妊娠的機會是年齡≤30歲UI患者的0.334倍；移植胚胎數是鮮胚移植臨床妊娠的保護因素(OR=3.055，P=0.038)。優質囊胚數是UI患者累積活產的保護因素(OR=7.493，P=0.000)(表5)。

表5 影響妊娠結局的多因素Logistic回歸分析

討 論

隨著晚婚晚孕、生活方式和環境因素的改變，越來越多的不孕患者尋求積極的治療，其中UI患者的數量也在明顯增加。抑郁、壓力和焦慮的問題顯著影響UI夫妻之間的感情。伴隨輔助生殖技術的迅速發展，IVF-ET技術被認為是UI患者最后的醫治方式，因其具有更高的妊娠率及活產率，也是最為有效的診療方案[6-7]。許多UI患者認為期待治療是“浪費時間”，希望臨床醫生通過IVF技術來幫助其盡快成功妊娠[8]。指南[2]推薦應參照對生育需求急迫程度，結合女性年齡、不孕年限等要素，給患者定制個體化的診療方案。目前開展UI病因研究并不多，本研究通過單因素分析發現UI患者IVF-ET治療過程中臨床及實驗室指標的特征，進一步探討影響IVF妊娠結局的多因素來指導臨床工作。

年齡是影響妊娠的重要因素，女性年齡超過30歲，自然妊娠的能力開始下降，35～40歲時顯著下降。本研究多因素回歸分析提示UI患者年齡>30歲是鮮胚移植臨床妊娠的不利因素。指南[2]提出對于年齡小于35歲，不孕年限不足2年的UI患者，在6～12個月的期待治療后，若未孕則建議積極治療；而年齡大于35歲，不孕年限超過3年的UI患者推薦積極治療。隨著年齡的增長，卵巢儲備功能下降，卵母細胞的數量及質量均下降。有研究顯示UI女性較輸卵管因素或男性因素的不孕女性卵巢儲備功能下降[9-11]。本研究中，評估卵巢儲備功能的指標FSH、AMH、AFC在兩組中的結果相似(P>0.05)，可能跟選取年輕且卵巢功能正常的人群有關。卵母細胞數量對自然妊娠成功影響不大，但在IVF過程中卻很重要，因為它們能影響累積結果[12]。卵母細胞質量差，在IVF治療過程中可表現為成熟卵母細胞比例降低、卵母細胞形態異常、受精潛能低、胚胎發育不良、囊胚形成率低等。導致卵母細胞質量差的最常見原因是自然衰老，這與卵母細胞線粒體效率降低和氧化應激增加密切相關；在年輕女性中，散發性基因突變可加速卵母細胞衰老，導致胚胎發育的嚴重缺陷[13]。Astbury等[14]認為一些UI女性在IVF期間更容易產生不成熟的卵母細胞，這與卵母細胞質量較差有關，反映在高水平的DNA損傷，可導致植入率和活產率顯著降低。因此卵母細胞的成熟，是成功受精及胚胎發育的基礎，提高卵母細胞成熟比例，有助于提高卵母細胞利用率。吳銳等[15]研究認為改進卵母細胞體外成熟(IVM)技術，有助于提高卵母細胞的利用率，減少激素用量，及降低OHSS的發生風險。Haas等[16]研究認為GnRH激動劑(GnRHa)聯合HCG雙扳機可以增加卵母細胞的數量、成熟卵母細胞和優質囊胚的數量。本研究發現年輕UI患者卵母細胞的成熟比例較對照組降低，對于卵母細胞成熟度較差的患者，可考慮行卵母細胞體外成熟(IVM)技術，待卵母細胞發育至MⅡ期，再行IVF/ICSI受精，將形成的胚胎行移植/冷凍處理；或者下一取卵周期延長Gn天數，放大HCG日主導卵泡徑線，或延長HCG扳機至取卵時間或在HCG日使用GnRHa聯合HCG雙扳機來增加卵母細胞的成熟比例。一項回顧性研究比較IVF與ICSI治療UI患者的效果，發現兩組患者受精失敗率相當(P>0.05)，IVF組活產率顯著高于ICSI組(P<0.05)，ICSI治療增加了胚胎學家的工作量，同時也增加了患者的醫療費用，建議UI患者優先行IVF受精[17]。本研究選用的精液大致正常，取卵當天首先行IVF短時受精，若未受精的卵母細胞比例超過1/3，則進行補救ICSI。UI組IVF受精率顯著降低(P<0.05)，補救ICSI發生率雖然不高(P>0.05)，但IVF結合補救ICSI，增加了部分UI患者卵母細胞的利用率，彌補了部分卵母細胞因質量缺陷導致的受精失敗，使得兩組患者受精率相當(P>0.05)。本研究UI組囊胚及優質囊胚的形成率均有顯著降低(P<0.05)，考慮年輕UI患者胚胎發育的潛能下降。在Siristatidis等[18]的研究中UI患者與其他因素不孕患者相比較，臨床妊娠率顯著降低(P<0.05)，活產率有下降趨勢(P>0.05)。本研究結果顯示，UI組的累積妊娠率顯著下降，累積活產率有下降趨勢，與上述研究結果一致。Ebner等[12]認為年輕UI患者可能存在卵母細胞質量下降，表現為卵母細胞成熟比例降低、對受精潛力、胚胎發育產生負面影響。

本研究鮮胚移植選擇1～2個優質卵裂胚，移植胚胎數目的增加有利于鮮胚移植臨床妊娠，但同時也增加了多胎妊娠及產科風險。經過囊胚培養可以篩選出發育潛能更好的胚胎，同時囊胚移植提高了子宮內膜窗口期與胚胎的同步性，從而提高了活產率[19]。FET移植優選優質單囊胚，對于卵巢儲備功能正常的<38歲的UI患者來說，弱化了年齡對累積活產的影響，使其不再是影響累積活產的主要因素。獲得更多的優質囊胚可明顯增加累積活產的機會。

綜上所述，本研究排除了高齡、免疫等導致卵巢儲備功能下降的情況，也排除了合并存在影響IVF結局的病理情況如子宮腺肌癥、未經治療的子宮內膜病變等，同時排除了中重度男方少弱畸精癥導致的受精障礙，采用首次行拮抗劑方案的病例，避免混雜因素過多產生偏倚。兩組病例未進行FET情況的比較，缺乏凍胚移植妊娠結局相關因素的分析，以后會逐步開展針對這部分的研究設計。UI患者存在潛在的累積活產下降的情況，可能與卵母細胞質量及胚胎發育潛能下降有關。年齡>30歲不利于UI患者鮮胚移植妊娠，增加移植胚胎數有利于鮮胚移植臨床妊娠；優質囊胚數是年輕UI患者累積活產很好的預測因子，但如何增加患者優質囊胚數量是臨床和實驗室需要去共同探討的問題。