病毒miRNA檢測與早產兒腦室周圍白質軟化癥關系的研究

吳秋萍 李 宏 文香淑 陳 姍 劉麗娟

1.珠海市婦幼保健院兒童腦發育與康復科，廣東珠海 519000；2.南方醫科大學珠江醫院兒科，廣東廣州 510000

腦室周圍白質軟化癥（periventricular leukomalacia in preterm infants，PVL）是早產兒常見的腦損傷方式，圍生期的感染及炎癥影響也是PVL大腦白質損傷的原因[1-2]，Gibson等[3]檢測了443例腦癱患兒和883例健康對照兒童中單純皰疹病毒1型（herpes simplex virus 1，HSV1）、單 純 皰 疹 病毒2型（herpes simplex virus 2，HSV2）、巨 細 胞 病毒（cytomegalovirus，CMV）、EB病 毒（epstein-Barr virus，EBV）等嗜神經病毒核酸的表達含量，發現腦癱患兒在圍生期高度暴露于上述皰疹病毒和腸道病毒中。本研究前期應用miRNA基因芯片檢測PVL早產兒及5例健康早產兒外周血清中miRNA的表達[4]，其中有差異表達顯著的4個病毒miRNA：sv40-miR-S1-5p、ebv-miR-BART8-3p、hsv1-miRH6-5p、hsv2-miR-H10，提示相關病毒感染引發炎癥反應可能參與PVL的發病。本研究應用生物學信息分析方法和實時熒光定量PCR（qRT-PCR）進行驗證miRNA基因芯片檢測結果，以證明病毒miRNA與PVL發表的關系。

1 資料與方法

1.1 一般資料

將2013年1月至2021年8月于南方醫科大學珠江醫院就診的7例早產兒PVL的患兒作為試驗組，5例健康早產兒為對照組。納入標準：試驗組患兒有早產病史（胎齡小于37周），生后有運動發育遲緩的臨床表現，查體有肢體肌張力增高，膝腱反射亢進，踝陣攣陽性等錐體束征陽性表現，頭顱磁共振檢查有側腦室周圍白質軟化的病灶表現。排除標準：患有遺傳代謝病、身體發育不良，嚴重肝腎疾病的患兒；對照組為早產兒（胎齡小于37周），生長發育里程碑正常，無發育異常表現的健康嬰兒。兩組嬰兒年齡、出生胎齡、性別比較，差異無統計學意義（P> 0.05），具有可比性。見表1。本研究經南方醫科大學珠江醫院醫學倫理委員會批準，且所有嬰兒檢測標本均獲得其監護人的同意，并且簽署相關知情同意書。

表1 兩組研究對象年齡、胎齡、性別比較

1.2 主要材料

Trizol RNA提取試劑（美國Invitrogen公司）、RNA逆轉錄試劑盒（美國promega公司）、焦碳酸二乙酯（DEPC，北京普瑞達生物有限公司）、RT-qPCR試劑盒（廣州萊德爾生物科技有限公司）、PCR擴增儀（鄭州博邦）、核酸蛋白測定儀（德國Eppendorf）、7500型快速實時熒光定量PCR儀（美國應用生物系統公司ABI）。

1.3 方法

1.3.1 標本采集 兩組研究對象均采集靜脈血液樣本2 ml，用EDTA管抗凝，離心吸取血清，分裝于1.5 ml EP管中，-80℃冰箱保存。

1.3.2 應用生物信息學方法進行靶基因預測及信號通路分析 對應用miRNA基因芯片檢測篩選出顯著差異表達的4個病毒miRNA，采用miRNA靶基因預測軟件（miRanda和targetscan）進行靶基因的預測，將兩個軟件預測的結果整合作為miRNA的候選靶基因。應用Gene Ontology（GO）分析將兩個數據庫預測的靶基因進行富集和分類，篩選出與感染、炎癥、免疫等密切相關的靶基因，并采用Pathway生物學通路分析進行相關信號通路預測。

1.3.3 應用qRT-PCR驗證4個病毒miRNA的差異表達 ①試驗組及對照組外周血標本進行總RNA提取，進行標本合格性檢測；②逆轉錄：在PCR的擴增儀上，使用逆轉錄酶進行逆轉錄，后續進行翻譯；③qRT-PCR定量：將逆轉錄后的標本進行實時PCR反應體系進行反應。

1.4 統計學分析

采用SPSS 13.0統計學軟件進行統計學分析，符合正態分布的計量資料以均數±標準差（x±s）表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗和兩獨立樣本非參數K-S檢驗進行分析，計量資料采用χ2檢驗。P< 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 病毒miRNA進行生物信息學分析

2.1.1 靶基因預測 對病毒miRNA（sv40-miRS1-5p、hsv1-miR-H6-5p、hsv2-miR-H10、ebvmiR-BART8-3p）進行靶基因預測。采用miRanda及targetscan兩個數據庫對篩選出的4個病毒miRNA進行預測，得到靶基因信息進行整合后作為4個病毒miRNA的候選靶基因。

2.1.2 GO分析結果 根據靶基因預測結果，對4個病毒miRNA進行GO分析靶基因富集、分類結果顯示，sv40-miR-S1-5p、hsv1-miR-H6-5p和hsv2-miR-H10與炎癥、感染和免疫等密切相關，見表2。

表2 GO分析富集的與PVL相關的靶基因數

2.1.3 與PVL相關的靶基因的Pathway生物通路圖 4個病毒miRNA經Pathway生物學信息通路分析，預測到其生物學信息通路與炎癥、免疫密切相關，包括：絲裂原活化蛋白激酶（mitosolysis activates protein kinase，MAPK）信號轉導通路、Toll樣受體生物學通路、缺氧誘導因子-1（hypoxia inducible factor-1，HIF-1）生物學通路及T細胞相關生物學通路。其中靶基因MyD88、TRAF6、IL1R、TLR6、IFN-αβR、TGFB、ERK、p38等與炎癥、免疫相關通路密切相關，位于MAPK和Toll樣受體信號通路上游的關鍵位置（圖1～2）。

圖1 MAPK相關生物通路圖

2.2 實時熒光定量PCR檢測驗證病毒miRNA差異表達

應 用qRT-PCR檢 測sv40-miR-S1-5p、hsv1-miR-H6-5p、hsv2-miR-H10、ebv-miR-BART8-3p4個病毒miRNA（圖3）。以miR-425為內參，其中sv40-miR-S1-5p、hsv1-miR-H6-5p、hsv2-miR-H10共3個病毒miRNA的相對表達量與對照組比較，差異有統計學意義（P< 0.05），與miRNA基因芯片結果一致（表3）。

表3 4個病毒miRNA相對表達量統計學分析表（x ± s）

圖2 Toll樣受體相關生物通路圖

圖3 病毒miRNA的擴增曲線及溶解曲線圖

3 討論

世界衛生組織統計，全世界每年約有1500萬早產兒（每10名活產嬰兒中就有1名）出生時間不到37周。早產是五歲以下嬰兒死亡的主要原因，每年出生的極低出生體重嬰幼兒約占400萬活產嬰兒的1.5%。盡管早產兒護理方面的持續發展顯著改善了極低出生體重兒（<1.5 kg）的生存率，但隨著生存率的提高，神經功能障礙、永久性運動障礙（即PVL）見于約10%的早產兒幸存者[5-7]。

miRNA是小的內源性非編碼RNA，用于在轉錄后調節基因表達。miRNA在轉錄過程中，與相應mRNA結合，從而在蛋白質水平進行調控，影響翻譯的效率，進而參與調節機體細胞的眾多生理過程。進一步研究表明，miRNA可與RNA病毒的基因組進行結合，從而影響病毒進入宿主后，病毒的復制及所引起相應的病理改變[8]。miRNA在腦損傷方面的研究正在擴大，因為miRNA是基因表達的關鍵調節因子，也是生物標志物開發有希望的候選者[9]。Cullen等[10-11]研究發現，miRNA在病毒入侵機體后，對機體組織進行選擇以及引發相關病癥或對組織進行損害均有重要意義。其中包括 EBV、HSV、CMV在內的多種病毒能夠編碼產生miRNA，進而上調或下調機體體內某些靶基因的水平，影響與病毒感染相關的免疫、炎癥因子、信號分子等，從而影響機體的炎性免疫反應。

本研究對既往應用miRNA基因芯片檢測PVL早產兒和健康早產兒外周血清中miRNA的表達，篩選出顯著差異表達的病毒miRNA進行生物學分析。采用GO分析對預測到的靶基因富集、分類結果顯示，4個病毒miRNA（sv40-miR-S1-5p、hsv1-miR-H6-5p、hsv2-miR-H10、ebv-miR-BART8-3p）的靶基因與炎癥、感染、免疫等密切相關。應用Pathway生物學信息通路分析，預測密切相關的生物學通路，其中包括Toll樣受體生物學信號通路、MAPK信號通路、T細胞受體信號通路及HIF-1信號通路等炎癥、免疫相關通路，其中靶基因MyD88、TRAF6、IL1R、TLR6、IFN-αβR、TGFB、ERK、p38等與炎癥、免疫相關通路密切相關，處于Toll樣受體信號以及MAPK信號通路的關鍵位置。進一步擴大樣本采用qRT-PCR技術檢測上述4個病毒miRNA，結果發現sv40-miR-S1-5p、 hsv1-miR-H6-5p、hsv2-miR-H10共3個病毒miRNA的相對表達量與對照組差異有統計學意義，與miRNA基因芯片結果一 致。提 示sv40-miR-S1-5p、hsv1-miR-H6-5p、hsv2-miR-H10在PVL的發病中起重要作用。

hsv1-miR-H6-5p和hsv2-miR-H10是 單 純皰疹病毒1型（HSV1）和2型（HSV2）分別編碼的miRNA，人類是HSV的自然宿主，可累及口腔、皮膚、黏膜、眼黏膜及中樞神經系統[12]。Gibson檢測的443例腦癱患兒和883例健康對照兒童中HSV1、HSV2、EBV、CMV等嗜神經病毒核酸的表達含量，發現腦癱患兒在圍生期高度暴露于上述皰疹病毒和腸道病毒中[3]。特定病毒的感染可能會影響人自身編碼的miRNA，上調或下調相關miRNA的表達水平，對病毒的感染進程起促進或抑制的作用。sv40-miR-S1-5p是猿猴空泡病毒40（simian vacuolating virus 40，SV40）編碼的miRNA[13]，有研究表明，SV40 對腦組織有親嗜性，可在人胎腦細胞內繁殖[14]。

Guo K等[15]發現在脂多糖誘導的PVL新生鼠模型中，miRNA在其發病機制中有重要調節作用。該研究使用miRNA微陣列分析檢測獲得104個與PVL相 關 的miRNA，用qRT-PCR對miRNA微 陣列驗證其表達差異，研究表明，PVL模型的miRNA表達譜與對照組相比有顯著變化。如miR-451表達升高，而rno-miR-200b表達顯著降低，進一步行生物學分析，發現其與炎癥反應通路密切相關，表明部分miRNAs在腦組織中存在差異表達，可能參與了發生PVL的分子機制，但其調節的基本機制尚未完全明了。

已有研究表明[16]，圍生期胎兒臍帶血和羊水組織中的炎癥相關細胞因子的水平上升和早產、腦癱的發生有較高關聯性。若臍帶血中IL-6>11 pg/ml的早產兒，PVL和腦室內出血的發生率為78%，而臍帶血中IL-L的水平< 11 pg/ml，腦損傷的發生率為30%。在PVL腦室周圍病灶中，大量炎癥細胞因子的活性顯著增高[17-18]，提示炎癥及感染相關因素在PVL的發病中占有重要位置。

本研究在PVL早產兒外周血中應用miRNA基因芯片檢測出顯著表達差異的4個病毒miRNA，生物學分析可知，其與炎癥相關的靶基因及生物學通路密切相關，并經qRT-PCR進一步驗證，sv40-miR-S1-5p、 hsv1-miR-H6-5p和hsv2-miR-H10共3個病毒miRNA存在顯著差異表達，與基因芯片結果一致，充分提示了這3個病毒miRNA可能在PVL的發病中產生影響。這些病毒感染可以發生在整個妊娠期，病毒感染后可呈潛伏感染狀態，可使母體反復感染，并有在整個妊娠期感染胎兒的能力，甚至在產時、產后感染新生兒。病毒進入機體后，相應病毒編碼miRNA表達變化，靶向作用于其靶基因，或調節機體內miRNA的表達水平變化，激活MAPK、Toll樣受體生物學信號通路，引起級聯反應，使宮內胎兒的炎癥因子出現大幅度上調，對胎兒腦組織產生直接或間接的損害，可導致PVL的發生。

外周血檢查特異地miRNA表達，有可能成為PVL早期診斷的指標，進一步擴大樣本，多中心協作，尋找PVL診斷的可靠指標。