地龍蛋白改善糖尿病勃起功能障礙大鼠的作用機制*

張愛平 武兵兵 劉黎明 冀小衛 王新平 王 鑫 剡 銳 馬玉虎 邢喜平**

1.甘肅中醫藥大學(甘肅 蘭州 730000);2.甘肅中醫藥大學附屬醫院(甘肅 蘭州 730020);3.蘭州大學第一醫院(甘肅 蘭州 730000);4.臨夏州婦幼保健院(甘肅 臨夏 731100)

我國糖尿病患者在逐年上升[1],持續的高糖環境會激活氧化應激與炎癥反應,進一步損傷大鼠睪丸、陰莖結構,導致睪酮降低,影響勃起功能[2]。 目前臨床主要以5 型磷酸二酯酶抑制劑(PDE5)對癥治療,但因其價格昂貴、不良反應較多、患者醫從性差且部分患者存在耐藥性,導致其使用有限。 中藥治療陰莖勃起功能障礙療效顯著,本文用地龍蛋白干預糖尿病勃起功能障礙(diabetes mellitus erectile dysfunction,DMED)大鼠。從中醫基礎理論到臨床實踐,為臨床治療DMED 提供理論依據、為實驗拓展新思路。

材料與方法

一、實驗動物、主要試劑和儀器

甘肅中醫藥大學動物實驗中心提供(許可證編號:SYXK(甘)2020-0001)SPF 級雄性60 只SD 大鼠,體質量200±20g,實驗經甘肅中醫藥大學動物實驗中心倫理委員會批準(編號:2020-149),符合實驗動物倫理委員會相關指導原則。 枸櫞酸西地拉非片(齊魯制藥有限公司,批號:1D0291D82);地龍蛋白(寶雞市方晟生物開發有限公司, 批號: 20210511); 鏈脲佐菌素(Streptozotocin,STZ)(北京索萊寶科技有限公司,批號:421D022);APO (阿 樸 嗎 啡, 美 國, APExBO, 批 號:B6936113377BD);核因子E2 相關因子2(nuclear factory erythroid-2 related,Nrf2)抗體(genetex,43950);核因子κB(nuclear factor-κB,NF-κB)、甘油酸-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH)抗體(immunoway,批號分別為B1101,B1501);超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)試劑盒(南京建成,20211015);丙二醛(Malon dialdehyde,MDA)試劑盒(南京建 成,20211015); 睪 酮(testosterone, T) 試 劑 盒(Sinobestbio,202112)。 血糖儀(愛科來醫療科技(平湖)有限公司);病理切片機(上海萊卡儀器有限公司);顯微拍照系統(奧林巴斯有限公司);酶標儀(美國Bio Rad 公司)。

二、建立DMED 大鼠模型、實驗分組及給藥

大鼠飼養于甘肅中醫藥大學動物實驗中心SPF級實驗室,自由進食飲水,室溫22℃～25℃,相對濕度45% ～55%,12h/12h 光照黑暗循環。 適應性喂養1周后,記錄血糖和體重作為基線,根據隨機數字表法選取50 只,通過腹腔注射STZ(50mg/kg)構建糖尿病大鼠模型,剩余10 只注射等量的檸檬酸鈉-檸檬酸緩沖液做空白組。 記錄隨機血糖。 若血糖＞16. 7mmol/L,則初步判定為糖尿病大鼠, 若期間隨機血糖＜16.7mmol/L,則被剔除實驗。[3]8 周后,參照Heaton[4]方法,選擇一安靜、光線昏暗房間,在大鼠頸部注射APO(100ug/kg),記錄30min 內陰莖有無勃起、陰莖勃起次數。 有勃起者剔除實驗,未見勃起者為DMED 大鼠,大鼠陰莖勃起的標準為:龜頭露出充血,包皮后退,陰莖膨大增長。 將建模成功的大鼠隨機分為5 組,空白組和模型組(生理鹽水10mL/kg)、西地那非組(5mg/kg)、地龍蛋白低劑量組(0.045g/kg)、地龍蛋白中劑量組(0.090g/kg)、地龍蛋白高劑量組(0.180g/kg),干預4 周。

三、陰莖海綿體內壓(ICP) 及平均頸動脈壓(MAP)的測定

大鼠腹腔注射3%戊巴比妥鈉(40mg/kg)使其麻醉,麻醉后剃除頸部、下腹部毛發,沿氣管兩側暴露頸總動脈,沿正中線暴露大鼠腹部,尋找前列腺,暴露海綿體神經。 將大鼠陰莖組織拖出,切開陰莖包皮,使用電極鉤住海綿體神經以刺激陰莖勃起,將PE-50 管內部充滿肝素生理鹽水對大鼠右側頸總動脈和海綿體進行插管。 記錄平均頸動脈壓(MAP)和勃起狀態下陰莖海綿體內壓力(ICP)的值。 使用生理鹽水清洗睪丸和海綿體組織,記錄其質量。 將海綿體組織分為三段,將一側睪丸和一段海綿體組織用4%多聚甲醛固定,其余放至-80℃冰箱保存。

四、大鼠一般情況、隨機血糖及體質量檢測

每周記錄大鼠隨機血糖、體重,觀察大鼠飲食,皮毛光澤度,大小便和精神狀態。

五、HE 染色觀察大鼠睪丸、陰莖組織病理形態學改變

各組大鼠睪丸、陰莖組織用4%多聚甲醛溶液固定,脫水,石蠟包埋,切片,二甲苯脫蠟,梯度乙醇脫水,蘇木素染色,伊紅染色,梯度乙醇脫水,二甲苯透明,中性樹膠封片,HE 染色后封片,于200 倍顯微鏡下觀察睪丸、陰莖組織結構改變。

六、檢測血清SOD、MDA、T 含量

血清SOD、MDA、T 含量,嚴格按照試劑盒操作步驟進行。

七、免疫組織化學染色方法檢測睪丸組織Nrf2、NF-κB的表達情況

將睪丸組織取材、固定、脫水、包埋切片,二甲苯及梯度酒精脫蠟,3%H2O2消除過氧化物酶,0.01M 檸檬酸鈉緩沖溶液(pH6.0)90℃進行抗原修復,5%BSA 封閉抗原,4℃孵育一抗(Nrf2 抗體1:400,NF-κB 抗體1 ∶250稀釋)過夜,滴加二抗37℃孵育1h,加入DAB 顯色,鏡下控制顯色時間,放入蒸餾水終止反應。 蘇木精染色,梯度酒精脫水,二甲苯透明,中性樹膠封片。 使用顯微拍照系統觀察各組片子。 使用ImageJ 計算各張片子灰度值。

八、數據分析采用SPSS25.0 軟件分析

實驗結果用均數±標準差(±s)表示,首先進行正態性及方差齊性檢驗,符合正態分布及方差齊性的計量資料采用兩組間比較,采用兩獨立樣本t檢驗,多組間數據比較采用單因素方差分析法(one-way ANOVA),非正態數據間兩兩比較采用秩和檢驗,P＜0.05 為有統計學意義。

實驗結果

一、大鼠勃起功能評價

與空白組相比, 模型組大鼠ICP 明顯下降(P＜0.01),與模型組相比,各治療組大鼠ICP 顯著提高(P＜0.01);與空白組相比,模型組大鼠ICP/MAP 下降(P＜0.01),與模型組相比,各治療組大鼠ICP/MAP 顯著提高(P＜0.01),各組間MAP 無顯著差異,見表1。

表1 藥物對大鼠勃起功能的影響

二、大鼠一般情況

空白組飲食正常,毛發色澤光亮、精神狀態良好,大小便一般。 模型組與西地拉非組大鼠毛色發黃,明顯消瘦,行動遲緩,精神萎靡,多飲多食,尿量增加;地龍蛋白組上述癥狀稍有改善。

三、地龍蛋白對大鼠血糖和體重的影響

與空白組相比, 造模后各組血糖顯著升高(P＜0.001),且穩定,造模情況良好。 治療后,與空白組相比,各組血糖明顯升高(P＜0.001),與模型組相比,各給藥組血糖無明顯差異(P＞0.05),見表2。

表2 藥物對大鼠血糖的影響(±s,n=6)

表2 藥物對大鼠血糖的影響(±s,n=6)

注:表示與空白組相比*P＜0.001。

組別 造模前 造模3 天 造模1 周 造模4 周 造模8 周 給藥2 周 給藥4周空白組 4.97±0.39 4.95±1.09 5.02±0.53 4.23±0.78 4.2 2±0.33 5.05±0.91 4.78±0.89模型組 4.07±0.58 26.32±5.20* 20.83±2.94* 24.37±3.76* 25.07±3.94* 24.65±3.75* 27.65±8.29*西地拉非組 4.12±0.19 24.75±6.68* 20.38±4.21* 24.62±6.67* 27.45±4.09* 25.42±4.87* 31.18±2.71*地龍蛋白低劑量組4.58±0.23 22.62±7.60* 21.23±2.73* 29.62±4.29* 27.02±4.34* 25.17±5.00* 24.35±6.31*地龍蛋白中劑量組4.28±0.39 23.81±5.78* 21.94±3.73* 22.01±2.21* 28.15±3.98* 23.43±4.13* 26.36±4.46*地龍蛋白高劑量組4.45±0.35 25.17±5.60* 23.13±3.98* 22.43±2.41* 27.45±3.96* 22.57±5.77* 24.37±7.02*

空白組大鼠體重隨時間延長增加明顯,各給藥組大鼠體重前4 周增加緩慢,4 周后體重開始下降;與空白組相比,治療后各組體重顯著下降(P＜0.001),與模型組相比各治療組體重無明顯差異(P＞0.05),見表3。

表3 藥物對大鼠體重的影響(±s,n=6)

表3 藥物對大鼠體重的影響(±s,n=6)

注:表示與空白組相比*P＜0.05,**P＜0.01,***P＜0.001。

組別 造模前 造模3 天 造模1 周 造模4 周 造模8 周 給藥2 周 給藥4周空白組 299.05±14.8 336.33±17.68 356.67±20.57 416.33±31.90 471.33±37.45 499.00±38.89 513.33±38.94模型組 297.50±15.03 293.83±15.08 299.00±30.72 321.17±35.82** 315.33±33.73*** 328.00±37.55*** 289.33±48.96***西地拉非組 305.50±11.41 298.00±15.02 315.00±19.35 328.50±27.38** 317.17±55.14** 303.50±42.31*** 276.00±46.03***地龍蛋白低劑量組 297.50±23.70 289.33±30.54 301.33±36.58 306.67±43.39** 324.50±27.90*** 304.17±37.37*** 256.17±45.11***地龍蛋白中劑量組 301.17±20.35 295.00±24.42 316.83±30.86 312.00±49.87* 303.83±48.35*** 322.00±43.82*** 287.83±62.51***地龍蛋白高劑量組 305.50±18.56 298.83±17.43 324.67±19.30 336.33±33.02* 335.67±28.16*** 254.17±26.80*** 312.33±29.34***

四、地龍蛋白對大鼠睪丸指數的影響

與空白組相比,模型組大鼠睪丸指數顯著降低(P＜0.01),與模型組相比,西地拉非組、地龍蛋白中劑量組、地龍蛋白高劑量組睪丸指數明顯增加(P＜0.01,P＜0.05,P＜0.01),地龍蛋白低劑量組無統計學意義見表4。 睪丸指數(睪丸指數指大鼠睪丸質量除以大鼠體重)

表4 藥物對大鼠睪丸指數的影響(±s,n=6)

表4 藥物對大鼠睪丸指數的影響(±s,n=6)

注:表示與空白組相比**P＜0.01;與模型組相比#P＜0.05,##P＜0.01。

組別 劑/g·kg-1 睪丸指數(%)空白組-0.448±0.069模型組 - 0.215±0.036**西地拉非組 0.005 0.412±0.102##地龍蛋白低劑量組 0.045 0.257±0.043地龍蛋白中劑量組 0.090 0.330±0.039#地龍蛋白高劑量組 0.180 0.417±0.061##

五、地龍蛋白對糖尿病大鼠睪丸組織的影響

空白組生精小管組織結構完整,形態如常,各級精細胞排列整齊,小管內可見成熟精子;模型組生精小管變形、萎縮、固化,生精上皮細胞不同程度的脫落;各藥物干預組相比于模型組均有不同程度的改善,其中西地拉非組和地龍蛋白高劑量組(地龍高)小管形態基本恢復,有成熟精子產生;地龍蛋白低劑量組(地龍低)萎縮程度較模型組有所改善見圖1。

圖1 大鼠睪丸組織HE 染色圖片(200×)

六、地龍蛋白對糖尿病大鼠陰莖組織的影響

空白組肌纖維、膠原纖維排列整齊,血竇結構完整,內含少量紅細胞;模型組肌纖維斷裂,膠原纖維擰集成條狀,血竇明顯減少;西地拉非組血竇明顯恢復,膠原纖維形態接近正常組;地龍蛋白高劑量組(地龍高)平滑肌肌纖維仍存在斷裂,但膠原纖維和血竇明顯恢復,地龍蛋白中劑量組(地龍中)和地龍蛋白低劑量組(地龍低)血竇較少,其中地龍蛋白低劑量組膠原纖維仍擰集,肌纖維斷裂較其他治療組明顯見圖2。

圖2 大鼠陰莖組織HE 染色圖片(200×)

七、地龍蛋白對血清SOD、MDA、T 含量

與空白組相比,模型組大鼠SOD、T 含量明顯減少(P＜0.01),MDA 含量明顯增加(P＜0.01),與模型組相比,各治療組SOD、T 含量明顯增加(P＜0. 001,P＜0.01),MDA 含量明顯減少(P＜0.01)見表5。

表5 藥物大鼠SOD、MDA、T 的影響(±s,n=6)

表5 藥物大鼠SOD、MDA、T 的影響(±s,n=6)

注:表示與空白組相比**P＜0.01;與模型組相比##P＜0.01,###P＜0.001。

組別 劑量/g·kg-1 SOD(U/ml) MDA(nmol/ml) T(nmol/L)空白組- 83.72±2.60 2.85±1.02 100.14±6.65模型組 - 38.52±1.43** 6.01±0.45** 41.51±2.88**西地拉非組 5×10-3 79.14±1.31### 2.94±0.61## 94.87±5.94##地龍蛋白低劑量組 0.045 63.73±2.25### 4.65±0.76## 64.29±5.15##地龍蛋白中劑量組 0.090 70.66±3.11### 3.51±0.74## 84.44±7.69##地龍蛋白高劑量組 0.180 78.10±1.62### 3.20±0.82## 92.83±2.24##

八、地龍蛋白對各組大鼠睪丸組織Nrf2、NF-κB 蛋白表達水平的影響

與空白組相比模型組大鼠睪丸組織Nrf2 明顯下降(P＜0.01),NF-κB 明顯增加(P＜0.01),與治療組相比,各給藥組Nrf2 明顯增加(P＜0.01),NF-κB 明顯減少(P＜0.01)見圖3、圖4。

圖3 Nrf2 免疫組化圖

圖4 NF-κB 免疫組化圖

討 論

陰莖勃起功能障礙(erectile dysfunetion,ED)指陰莖勃起狀態下海綿體硬度和堅硬時間明顯低于正常水平,持續不能達到并保持足以使性行為滿意的勃起狀態[5]。 糖尿病勃起功能障礙的發病機制與糖尿病患者循環高糖毒性導致的陰莖血管內皮和平滑肌病變、感覺神經功能障礙、性激素水平紊亂和心理精神因素等有關,其中T 水平低下是重要的致病機制[6]。 高糖環境會激活氧化應激,導致活性氧(ROS)的產生超出了抗氧化能力,從而引發廣泛的氧化應激損傷,損傷睪丸組織,導致睪丸間質細胞(Leydig)細胞凋亡增加[7-9],影響人體T 的合成和分泌。 早期認為T 與勃起無關,僅僅對性欲有維持作用[10]。 最近研究發現,T 作用于雄激素受體,有利于平滑肌細胞保持正常的形態與功能[11]。 劉波[12]等人發現10-5mol/L T 對體外培養的大鼠海綿體SMCs 和成纖維細胞的增殖具有促進作用,有利于海綿體生長,能夠改善男性性功能作用。 此外,睪酮水平與陰莖一氧化氮合酶基因的表達密切相關[13]。血清T 下降,會抑制陰莖一氧化氮合成酶合成,導致陰莖一氧化氮合成的減少,抑制NO-cGMP 信號通路,降低cGMP 含量,最終導致ED 發生[14],糖尿病患者睪酮合成與分泌減少,可能與睪丸組織損傷、性腺分泌軸功能損傷相關[15]。 本研究也證實DMED 大鼠血清中的睪酮含量明顯下降。

Nrf2 是最重要的內源性抗氧化反應分子[16-17],Nrf2及其內源性抑制劑Kelch 樣ECH 關聯蛋白1(Kelch like ECH associated protein 1,Keap1)作為一種普遍存在的、進化上保守的細胞內防御機制來抵消氧化應激。 正常情況下Nrf2 與Keap1 結合,并有靶向蛋白酶體降解,在機體受到氧化應激的情況下,Nrf2 從Keap1 分離并易位至細胞核,在此與一種小Maf 蛋白異二聚化。 異二聚體識別抗氧化反應元件(antioxidant response element,ARE)[18],可上調醌氧化還原酶(Quinone oxidoreductase,NQO1)、過氧化氫酶(catalase,CAT)、SOD、谷胱甘肽硫轉移酶(glutathione S-transferase,GST)的表達,對抗氧化酶基因的表達具有重要作用[19],此外還可抑制促炎因子的表達[20-21],NF-κB 是炎癥損傷中起關鍵作用,可介導白介素-6(Interleukin-6,IL-6)、白介素-8(Interleukin-8,IL-8)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)等細胞因子和趨化因子產生,在控制炎癥損傷中起關鍵作用[22]。 大量研究表明,活化的Nrf2 分子對NF-κB 具有抑制作用,Nrf2 在抵消NF-κB驅動的炎癥反應中起著關鍵作用[23-25]。

本研究結果顯示,空白組大鼠血糖穩定,體重逐漸增加,其余各組注射STZ 后大鼠血糖顯著升高,糖尿病大鼠模型構建穩定。 持續的高糖環境會導致DMED 大鼠Nrf2、SOD、T 含量明顯下調,同時NF-κB、MDA 等炎癥因子和氧化終產物增加。 經地龍蛋白干預后睪丸組織Nrf2 表達上調,同時DMED 大鼠血清SOD、T 含量增加;而炎癥因子NF-κB 和氧化最終產物MDA 釋放減少。 證明地龍蛋白具有改善睪丸組織氧化應激、炎癥反應作用,從而增加血清T 含量,有利于改善大鼠勃起功能。

綜上所述,本研究利用糖尿病大鼠勃起功能障礙模型,探討地龍蛋白對糖尿病勃起功能障礙的改善機制,其可能與地龍蛋白激活睪丸組織Nrf2 通路,抑制NF-κB 蛋白,發揮抗氧化應激、抑制炎癥反應來保護睪丸組織,增加血清T 含量相關,為臨床治療糖尿病性勃起功能障礙提供理論依據。 糖尿病勃起功能障礙是多因素介導,其發病機制復雜,關于地龍蛋白通過其他相關途徑發揮作用以及具體作用機制,未來值得探究。