大口黑鱸抗繆勒氏管激素（AMH）原核表達及多克隆抗體制備

郭 琦， 王向斌， 黃 茜， 梁子怡， 王心雨， 劉慧芬＊

（河南師范大學水產學院， 河南新鄉 453007）

抗繆勒氏管激素（Anti-Müllerian hormone，Amh）又稱繆勒氏管抑制物， 是轉化生長因子-β（Transforming growth factor-β，TGF-β） 超家族中的一員[1]。在哺乳動物中，Amh表達于精巢的支持細胞，可引起繆勒氏管的退化，維持雄性特征[2]。 雌性個體中，Amh在原始卵泡的募集以及優勢卵泡選擇中發揮重要作用[3]。 雖然絕大多數魚類沒有繆勒氏管，但是卻保留了Amh基因。 2002年在日本鰻鱺中發現Amh基因，主要在支持細胞中表達，與精子發生有關[4]。 硬骨魚類中，雖然Amh主要在雄性性別分化中發揮關鍵作用，但其在雌性卵巢中也有表達。 在斑馬魚中敲除Amh基因會導致卵巢肥大，初級卵母細胞數量顯著增多，卵母細胞發育進程受阻[5]。 使用花鰭骨AMH重組蛋白對卵母細胞進行體外孵育， 結果發現AMH重組蛋白可以促進花鰭骨卵母細胞成熟[6]。這說明Amh在魚類性腺發育過程中發揮一定作用。

大口黑鱸（Micropterus salmoides），又名加州鱸，隸屬于鱸形目 （Perciformes）、 太陽魚科（Cehtrachidae）、黑鱸屬（Micropterus），具有肉質鮮美、抗病力強、 生長迅速、 適溫范圍較廣等優點。 大口黑鱸自1983年被引入內地以來， 在全國多地區實現了人工養殖[7]。目前關于大口黑鱸品種開發、營養品質、養殖模式分析等方面已有較多研究， 但是有關其性腺發育及相關分子調控機制的研究鮮有報道。

本研究利用已經獲得的大口黑鱸Amh基因cDNA全長序列，構建原核表達載體，制備多克隆抗體，以期為研究Amh基因的功能及其在大口黑鱸性腺發育中的分子機制提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與主要試劑

大口黑鱸購自于新鄉市洪門鎮鱸魚養殖基地，暫養于河南師范大學水產養殖基地。 用于多克隆抗體制備的小鼠購自華蘭生物工程股份有限公司。

感受態細胞、限制性內切酶、pET-32a（+）載體等購自寶日醫生物技術(北京)有限公司。 彩虹180廣譜蛋白Marker、 弗氏佐劑等購自北京索萊寶科技有限公司。His Tag HP鎳柱購自上海生工生物工程股份有限公司。 實驗所用引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2 原核表達載體構建

根據Amh基因序列， 選擇合適的區域設計特異性引物， 同時根據原核表達載體pET32a的圖譜選取酶切位點，具體信息見表1：

表1 重組載體引物

以大口黑鱸卵巢cDNA為模板，通過PCR擴增序列、 瓊脂糖凝膠電泳回收PCR產物。 將回收產物和pET-32a質粒用BamH I 和Xho I限制性內切酶雙酶切（37℃，過夜），酶切產物純化后，構建重組表達載體pET32a-AMH。 將重組質粒轉化至BL21感受態細胞中，挑選陽性克隆送至生工生物工程（上海）股份有限公司測序， 采用DNAMAN軟件對測序結果進行比對分析，以判斷目的基因是否正確插入載體。

1.3 融合蛋白誘導表達

將陽性表達菌接入LB液體培養基中進行擴大培養（取部分菌液作為對照），37℃震蕩培養至OD6000.5左右， 向其中加入IPTG （Isopropyl β-D- Thiogalactopyranoside，終濃度1 mmol/L）進行誘導表達，37℃震蕩培養，在培養6 h、8 h、10 h及12 h后取材，12000 rpm離心20 min，收集沉淀。菌體沉淀以4×loading buffer重懸裂解，隨后使用SDS-PAGE對總菌體、沉淀和上清進行檢測。

1.4 融合蛋白純化及抗體制備

用上述條件大量誘導蛋白， 在室溫下8000 rpm離心5 min收集菌體， 加入適量變性結合緩沖液，超聲波破碎 （破3 s， 停3 s， 功率50%， 破碎總時間30 min），獲得融合蛋白，用His Tag HP柱純化蛋白。蛋白純化所需試劑配制及操作方法參照馮軍廠的方法[8]。 用純化透析后的融合蛋白免疫小鼠，每隔一周加強免疫一次， 首次將融合蛋白與弗氏完全佐劑等比混合后對小鼠進行皮下注射， 之后每次將融合蛋白與弗氏不完全佐劑等比混合后注射，4周后采血獲得抗血清。

1.5 抗體效價檢測

利用酶聯免疫 （enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）法檢測制備抗體的效價，測定時以未免疫的小鼠血清作為陰性對照。

1.6 數據分析

采用SPSS 22.0統計分析， 不同組之間的差異顯著性（P＜0.05）采用單因素方差分析（ANOVA）進行檢驗，Duncan氏方法多重比較， 實驗數據均使用平均值±標準誤（mean ± SE）表示。

2 結果與分析

2.1 重組表達載體構建

以大口黑鱸卵巢cDNA為模板進行擴增，獲得的目的片段與預期大小一致 （圖1 a）。 重組質粒pET32a-AMH經單雙酶切驗證， 檢測目的片段已成功導入表達載體（圖1 b）。 隨后，將產物進行純化、測序，結果表明構建的pET32a-AMH正確。

圖1 Amh目的片段擴增及驗證

2.2 重組蛋白誘導表達及可溶性檢測

構建好的重組質粒pET32a-AMH轉入大腸桿菌BL21。 隨后采用IPTG在16℃下進行誘導，SDS-PAGE檢測發現，在52.3 kDa左右出現目的條帶，而對照在同一區域未出現特異條帶， 表明重組表達載體pET32a-AMH構建成功。 誘導后菌體經超聲破碎、離心、SDSPAGE電泳分析表明重組蛋白主要存在于沉淀中。

2.3 重組蛋白純化

對誘導菌液進行收集、破碎，利用親和純化的方法，對AMH融合蛋白進行純化。使用不同濃度咪唑洗脫液洗脫蛋白，SDS-PAGE 電泳檢測結果顯示，100 mM咪唑洗脫時開始檢測到目的蛋白；150 mM和200 mM咪唑洗脫時，檢測到大量的目的蛋白，但是200 mM 咪唑濃度洗脫時，獲得的目的蛋白純度更高（圖2）。經透析去除雜質，SDS-PAGE電泳檢測結果顯示，純化后的雜蛋白明顯減少，條帶較為單一，可用于后續實驗（圖3）。

圖3 AMH重組蛋白不同濃度咪唑洗脫結果

圖4 AMH重組蛋白純化

2.4 AMH多克隆抗體制備及效價檢測

經過4次免疫，獲得鼠源AMH抗血清。 使用酶聯免疫吸附方法對獲得的多克隆抗體血清進行效價測定，結果顯示多克隆抗體的效價為2.7×105，可為后續實驗提供原材料。

3 討論

抗繆勒氏管激素是轉化生長因子家族成員之一，在哺乳動物中具有調節細胞發育及分化，誘導繆勒氏管退化，維持雄性特征的作用。當前已有較多研究表明，Amh在哺乳動物卵巢發育過程中發揮一定作用。 在硬骨魚類中，Amh多被當作雄性性別分化關鍵基因。 尼羅羅非魚XX個體中，amhy的過表達導致了雌性到雄性的性逆轉[9]。 也有研究表明，Amh在雌性個體卵巢發育過程中發揮一定作用。 在黑鯛研究中發現，Amh在卵巢發育早期不表達，在卵黃蛋白原合成期表達量升高[10]。 斑馬魚中的研究發現，Amh缺失會導致雌魚性腺發育不良，卵泡發生受阻[11]。 這說明，Amh基因在魚類性腺發育過程中發揮重要作用。

原核表達是外源基因融合表達的方式之一， 具有易培養、生長快、操作簡單等優點[12]。 多克隆抗體具有穩定性較好、制備技術要求不高、周期短、成本低等優點，廣泛用于蛋白亞細胞定位、蛋白互作、細胞信號通路等研究領域[13]。 本研究利用獲得的大口黑鱸Amh基因序列，成功構建pET32a-AMH原核表達載體，誘導出大小為52.3kDa的AMH重組蛋白， 與奧利亞羅非魚49kDa的AMH重組蛋白[14]及雙須骨舌魚48kDa的AMH重組蛋白[15]大小相近。隨后通過免疫小鼠，獲得AMH多克隆抗體，利用ELISA對抗體血清進行效價檢測，結果顯示多克隆抗體的效價為2.7×105，可用于后續研究。

本研究通過構建大口黑鱸AMH原核表達載體，獲得AMH重組蛋白，利用重組蛋白對小鼠進行免疫，獲得AMH多克隆抗體。 獲得的大口黑鱸AMH重組蛋白和多克隆抗體可為后續研究Amh在大口黑鱸中的功能和作用機制提供基礎。