舟山市城區內河道地表水菌株分離與鑒定

王開揚鄭剛 楊志堅肖金星苗周迪干滿水

(1.浙江大學 舟山海洋研究中心，浙江 舟山 316100；2.舟山市生態環境局定海分局，浙江 舟山 316100)

舟山市是我國養殖業和國際貿易重點區域，隨著我國現代化的推進，工業生產所帶來的工業廢水排放量逐漸增加。這些工業廢水不經處理即被排放至舟山市周遭的地表水內，從而使得地表水污染越來越嚴重[1-2]。據統計，舟山市工業廢水和生活污水排放總量占全市廢水總排放量的50.6%，這表明人類生產生活所產生的工業及生活污水成為舟山市市域地表水的主要污染源[3]。現階段舟山市主要地表污染表現為有機污染物、氮和磷等的污染負荷較高，整體水質呈劣V類狀況，且在少雨季節，城區河道出現發黑、發臭現象[4]。因此對舟山市周遭地表水進行污染治理刻不容緩。

微生物循環馴化系統是一種基于污染水體中原有的有機物、營養鹽作為營養組分，結合培養工藝，將高效益生菌種進行馴化培養的地表水處理工藝[5]。該方法的特點是可以將外源益生菌與土著微生物相結合，在不破壞土著微生物的自然生態條件的情況下，有效地提高水體自凈能力并恢復受污染水體的水生態系統[6-7]。相較于傳統微生物和地表水治理技術，該處理工藝具有治污效率高、水質維護范圍廣、除污能力強和維護成本低等特點，更適用于城市周遭地表水環境的治理[8]。使用該工藝治理地表水時，需先全面了解受污染區域的土著微生物分布情況，并針對其區域菌種特性進行工藝調整，以達到最優的處理效果[9-10]。

本文以舟山市的城關河、城西河、洋岙河、慶豐河、蓬萊河、環南河、解放河、盛家塘等8處河道為研究采樣對象，使用牛肉膏蛋白胨固體平板培養基的平板涂布法，對樣品分離純化，再結合基因測序對菌株進行基因分析，研究對象中微生物的組成情況，以期為舟山市周遭河道治理提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗耗材

實驗所用牛肉膏、蛋白胨、氯化鈉、氫氧化鈉、瓊脂、鹽酸均采購于上海滬試試劑有限公司，純度均為優級純。

1.2 實驗儀器

基因測序儀(ABI3730，美國賽默飛科技有限公司)、恒溫培養箱(302A，常州市凱航儀器有限公司)、高壓滅菌鍋(LDZM-40KCS-II，廣州瑞豐設備儀器有限公司)、精密電子天平(FA-E型，常州市幸運電子設備有限公司)、pH計(pHS-1，優萊博技術(北京)有限公司)、玻璃器皿若干。

1.3 實驗方法

1.3.1 實驗準備

實驗前期準備主要包括玻璃器皿的洗滌、滅菌和培養基的制備分裝工作。其中玻璃器皿的洗滌主要先使用純水浸泡，隨后配合毛刷和清洗劑清洗玻璃器皿上的頑固污漬，最后將洗滌干凈的玻璃器皿置于烘箱中烘干。玻璃器皿的滅菌工作是用加壓蒸汽滅菌法進行滅菌，將清洗過后的玻璃器皿置于滅菌鍋內，在120℃條件下滅菌30min，滅菌結束后置于恒溫烘箱中烘干備用。培養基的制備工作如下：將0.5g牛肉膏、1g蛋白胨、2g瓊脂和0.5g氯化鈉置于100mL的滅菌水中，加熱攪拌均勻后，使用氫氧化鈉或鹽酸調節培養基pH值。待培養基冷卻至60℃時，制作斜面平板培養基。

1.3.2 樣品采集

實驗取采樣水域的水面下10—15cm的深層水樣，將帶蓋的滅菌玻璃瓶瓶口向下置于水中，再將瓶口朝正取出玻璃塞，待樣品灌滿取樣瓶后再蓋上玻璃塞，并及時避光冷藏保存，帶回實驗室后立即進行實驗分析。

1.3.3 樣品分離及培養

實驗使用平板表面涂布法處理待測樣品，實驗用先取1mL待測樣品置于預先裝好9mL無菌水的樣品管中，再搖勻并重復數次，可得濃度為10-6的菌液。隨后吸取一定量稀釋過的菌液置于預先制備好的牛肉膏蛋白胨培養基培養平板上，再使用三角刮刀在平板上涂抹均勻，最后將培養基置于37℃的恒溫烘箱中培養。待菌落長出后，將長出的菌株重復分離，直至獲得純菌。

1.4 菌株分析

1.4.1 初步分析

由于各個菌株在培養中生長情況有差異，需要基于其菌落形狀、大小、結構、高度、氣味、顏色、透明度及質地來初步分析菌株的類型。

1.4.2 基因測序分析

取1.0 μL的待分析樣，加入9.0 μL的Formamide deionized(Amresco公司)，在95 ℃條件下變性3min后立即冰水浴5min，隨后在基因測序儀上進行基因片段分析，使用自帶軟件對待測物的基因片段大小、峰圖顏色和突變位置進行分析，以確定待測物的菌落種類。

2 結果與討論

2.1 菌株統計

2.1.1 城關河菌株統計

城關河地表水樣品中分離可得10種菌株，其中包括細菌菌株BS0200(1-1)、貝萊斯芽孢桿菌(Bacillusvelezensis)TPS3N(1-2)、甲基營養型芽孢桿菌(Bacillusmethylotrophicus)EGY-SCJ5(1-3)、油菜科假單胞菌(Pseudomonasoleovorans)B21(1-4)、門多薩假單胞菌(Pseudomonasmendocina)ATCC 25411(1-5)、中山井芽孢桿菌(Bacillusnakamurai)NRRL B-41091(1-6)、蒼白桿菌(Ochrobactrumanthropi)ATCC 49188(1-7)、金黃桿菌(Chryseobacteriumcucumeris)GSE06(1-8)、金路德維希腸桿菌(Enterobacterludwigii)EN-119(1-9)和阿氏芽孢桿菌(Bacillusaryabhattai)B8W22(1-10)，各菌株分析相似度如圖1所示。由圖1可知，整體菌株分析結果相似度都在98.5%以上，表明樣品分離純化結果和樣品分析結果良好。

圖1 城關河菌株分析相似度

2.1.2 城西河菌株統計

城西河地表水樣品中分離可得7種菌株，其中包括三價砷氧化細菌(Acidovoraxsp.)R022(2-1)、波希不動桿菌(Acinetobacterbrisouii)5YN5-8(2-2)、金黃桿菌(Chryseobacteriumlineare)XC0022(2-3)、貝萊斯芽孢桿菌(Bacillusvelezensis)FZB42(2-4)、鞘氨醇盒菌屬(Sphingopyxissolisilvae)R36698(2-5)、德氏食酸菌(Acidovoraxdelafieldii)133(2-6)、黃桿菌屬(Flavobacteriumnotoginsengisoli)SYP-B540(2-7)，各菌株分析相似度如圖2所示。其中除(Sphingopyxissolisilvae)R36698(2-5)相似度低于98%外，其他菌株相似度均高于98%，表明結果可信度較高。

圖2 城西河菌株分析相似度

2.1.3 洋岙河菌株統計

洋岙河地表水樣品中分離可得7種菌株，其中包括杰氏棒桿菌(Chryseobacteriumaquaticum)10-46(3-1)、貪噬菌屬(Variovoraxparadoxusstrain)S004b(3-2)、寡養單胞菌(Stenotrophomonassp.strain)47(3-3)、假單胞菌屬(Pseudomonassp.)P41(3-4)、固氮螺菌(Azospirillumsp.)BPM34(3-5)、貝萊斯芽孢桿菌(Bacillusvelezensis)FZB42(3-6)、三價砷氧化細菌(Acidovoraxsp.)R022(3-7)，各菌株分析相似度如圖3所示。由實驗結果可知，各菌株分析結果可信度均高于98.5%。

圖3 洋岙河菌株分析相似度

2.1.4 慶豐河菌株統計

慶豐河地表水樣品中分離可得3種菌株，其中包括假單胞菌屬(Pseudomonasoleovoranssubsp.)LPB0305(4-1)、未培養的細菌克隆(Unculturedbacteriumclone)2-57(4-2)和三價砷氧化細菌(Acidovoraxsp.)R022(4-3)，各菌株分析相似度如圖4所示。

圖4 慶豐河菌株分析相似度

2.1.5 蓬萊河菌株統計

蓬萊河地表水樣品中分離可得5種菌株，其中包括根瘤菌(Rhizobiumrosettiformansstrain)S1(5-1)、未培養的γ蛋白桿菌基因(Unculturedgammaproteobacteriumgene)(5-2)、桿菌屬(Bacteriumstrain)BS0660(5-3)、假單胞菌(Pseudomonasputidastrain)Xuyi_350_2(5-4)、蒼白桿菌屬(Ochrobactrumsp.strain)JZ28(5-5)，各菌株分析相似度如圖5所示。

圖5 蓬萊河菌株分析相似度

2.1.6 環南河菌株統計

環南河地表水樣品中分離可得6種菌株，其中包括寡養單胞菌(Stenotrophomonassp.strain)SNH_K97(6-1)、假單胞菌(Pseudomonassolistrain)CAU 1560(6-2)、無色菌(Achromobactermucicolensstrain)LZU-1(6-3)、寡養單胞菌(Stenotrophomonasmaltophiliastrain)Xuyi_402_1(6-4)、蒼白桿菌屬(Ochrobactrumsp.strain)P6(6-5)、貝萊斯芽孢桿菌(Bacillusvelezensis)FZB42(6-6)，各菌株分析相似度如圖6所示。

圖6 環南河菌株分析相似度

2.1.7 解放河菌株統計

解放河地表水樣品中分離可得5種菌株，其中包括假單胞菌(Pseudomonassp.strain)KUDC6083(7-1)、寡養單胞菌(Stenotrophomonasmaltophiliastrain)PRNB7(7-2)、中華根瘤菌(Sinorhizobiumsp.strain)CK-23(7-3)、劍菌屬(Ensiferadhaerensstrain)NK22(7-4)、根瘤菌(Rhizobiumsp.strain)HPB5(7-5)，各菌株分析相似度如圖7所示。

圖7 解放河菌株分析相似度

2.1.8 盛家塘菌株統計

盛家塘地表水樣品中分離可得4種菌株，其中包括假單胞菌(Pseudomonasmosseliistrain)yy161(8-1)、假單胞菌(Pseudomonasputidastrain)DSS-CAP-4(8-2)和根瘤菌(Rhizobiumsp.strain)SCAU410(8-3)和寡養單胞菌(Stenotrophomonasmaltophiliastrain)SJTL3(8-4)，各菌株分析相似度如圖8所示。

圖8 盛家塘菌株分析相似度

2.2 典型菌株特征

篩選各河流區域的典型菌株從直徑、顏色、邊緣、是否凸起、干濕程度、透明程度及革蘭氏染色結果并結合儀器分析相似度進行菌落種類分析。

2.2.1 菌株1-8特征分析

菌株分離培養圖如圖9-1a、9-1b所示，菌落直徑約0.8 mm，顏色呈金黃色，邊緣整齊，凸起，菌落干燥，不透明，革蘭氏染色呈陰性。該特征與基因測序分析所得的金黃桿菌菌落特征一致，可推斷菌株為金黃桿菌(Chryseobacteriumcucumerissp.strain)(1-8)。

圖9-1 菌株培養基及革蘭氏染色(左a、右b)

2.2.2 菌株2-1特征分析

菌株分離培養圖如圖9-2a、9-2b所示，菌落直徑約0.3 mm，顏色呈白色，邊緣整齊，凸起，菌落濕潤，不透明，革蘭氏染色呈陰性。該特征與基因測序分析所得的三價砷氧化細菌特征一致，可推斷菌株為三價砷氧化細菌(Acidovoraxsp.strain)(2-1)。

圖9-2 菌株培養基及革蘭氏染色(左a、右b)

2.2.3 菌株3-3特征分析

菌株分離培養圖如圖9-3a、9-3b所示，菌落直徑約0.5mm，白色，邊緣整齊，凸起，濕潤，不透明；在顯微鏡下細胞呈橢圓形，細胞單個、成對或成鏈，革蘭氏染色呈陽性。該特征與基因測序分析所得的寡養單胞菌菌株特征一致，可推斷該菌株為寡養單胞菌菌株(Stenotrophomonassp.strain)(3-3)。

圖9-3 菌株培養基及革蘭氏染色(左a、右b)

2.2.4 菌株3-4特征分析

菌株分離培養圖如圖9-4a、9-4b所示，菌落直徑約4mm，白色，邊緣整齊，凸起，濕潤，不透明；在顯微鏡下細胞呈橢圓形，細胞單個、成對或成鏈，革蘭氏染色陽性。該特征與基因測序分析所得的假單胞菌屬(Pseudomonassp.)P41特征一致，可推斷該菌株為假單胞菌屬(Pseudomonassp.)P41。

圖9-4 菌株培養基及革蘭氏染色(左a、右b)

2.2.5 菌株5-5特征分析

菌株分離培養圖如圖9-5a、9-5b所示，菌落直徑約2mm，淺白色，邊緣整齊，凸起，濕潤，不透明；在顯微鏡下細胞呈棒槌形，中間略窄，單個、成對或成鏈，革蘭氏染色呈陽性。該特征與基因測序分析所得的蒼白桿菌屬菌株特征一致，可推斷該菌株為蒼白桿菌屬(Ochrobactrumsp.strain)JZ28。

圖9-5 菌株培養基及革蘭氏染色(左a、右b)

2.2.6 菌株8-3特征分析

菌株分離培養圖如圖9-6a、9-6b所示，菌落直徑約6mm，淺白色，邊緣呈發散毛刺狀，凸起，干燥，不透明；在顯微鏡下細胞呈圓形，整體呈“T”形，革蘭氏染色結果為陽性。該特征與基因測序分析所得的根瘤菌菌株特征一致，可推斷該菌株為根瘤菌(Rhizobiumsp.strain)SCAU410。

圖9-6 菌株培養基及革蘭氏染色(左a、右b)

3 結語

本研究基于牛肉膏蛋白胨固體平板培養基的平板涂布法對城關河、城西河、洋岙河、慶豐河、蓬萊河、環南河、解放河、盛家塘等8處河道的菌株進行分離提純，再結合ABI3730基因測序儀對其特征基因段進行分析，以研究各河道菌株主要分布及組成。由實驗結果可知，城關河、城西河、洋岙河、慶豐河、蓬萊河、環南河、解放河、盛家塘等8處河道中各分離出10、7、7、3、5、6、5、4種菌株，合計共47種菌株，其中共有6種特征菌株，其基因測序結果分別為金黃桿菌(Chryseobacteriumcucumerissp.strain)(1-8)、三價砷氧化細菌(Acidovoraxsp.strain)(2-1)、寡養單胞菌(Stenotrophomonassp.strain)(3-3)、假單胞菌(Pseudomonassp.strain)P41(3-4)、蒼白桿菌(Ochrobactrumsp.strain)JZ28(5-5)、根瘤菌(Rhizobiumsp.strain)SCAU410(8-3)，其中各典型菌株的菌落特征、細菌形貌及革蘭氏染色結果與各細菌特征一致。此實驗結果可作為舟山市周遭河道治理的實驗依據。