單細胞測序技術在兒童肝母細胞瘤中的應用前景

郭敬杰，王建堯，王斌（通信作者）

1.中國醫科大學深圳市兒童醫院，廣東 深圳 518026；2.深圳市兒童醫院 普外科，廣東 深圳 518026

0 引言

肝母細胞瘤（hepatoblastoma，HB）作為兒童期最常見的原發性肝臟惡性腫瘤之一，占5歲以下兒童肝臟腫瘤的90%以上，占兒科腫瘤的1%，發病率為1.2～1.5/百萬兒童[1]。近年來隨著早產兒和低體重嬰兒存活率增加，HB的發病率有所增加。HB患兒一般表現為較大腹部包塊和異常增高的甲胎蛋白水平，患兒出現明顯的臨床癥狀一般較晚，腫瘤體積一般較大，大部分患兒錯過了一期手術切除的機會，目前的診療方案主要是新輔助化療聯合化療后手術切除。

目前對HB研究主要認為Wnt/β-連環蛋白信號通路在腫瘤的發生發展中起到重要作用，在HB中β-連環蛋白的突變率高達50%～90%[1-2]。HB的DNA顯示全局低甲基化，伴隨著特異性腫瘤抑制基因的高甲基化也是研究的熱點內容[3]。在腫瘤發生發展中，腫瘤微環境會發生變化，其中免疫細胞會出現急劇的變化。單細胞測序可以在細胞層面進行研究，對不同細胞類群的變化、基因表達的上下調非常敏感，探究免疫逃逸發生的機制，可以為免疫靶點治療提供指導。

1 ScRNA-seq在腫瘤中的應用

自從2009年，Tang等在Nature Methods雜志上發表關于ScRNA-seq的文章，ScRNA-seq廣泛應用于各種動植物、微生物的研究，實現了組織到細胞的飛躍，目前scRNA-seq也提升到了三代測序，廣泛應用于各種研究，比如了解肺癌患者和結直腸癌患者腫瘤微環境特征、乳腺癌免疫細胞表型在腫瘤微環境中的特征、腎癌細胞的特征、產前診斷等[4]。

目前應用ScRNA-seq在HB中的實例很少，有研究前景；例如Bondoc等通過對腫瘤組織、背景肝臟、患者來源的異種移植物（PDX）進行單細胞測序對比研究，清晰鑒定了不同來源的細胞類群。PDX中鑒定出腫瘤驅動細胞簇（Tr2）以及腫瘤維持細胞群（Tr0、Tr3、Tr5和Tr4/1），在未來可能應用于控制腫瘤生長[5]。

2 ScRNA-seq技術

ScRNA-seq不同于傳統的測序技術，傳統的測序技術也可以實現對基因表達量的研究，是對總體樣本的研究，無法實現異質性研究。而ScRNA-seq是對單個細胞層面的研究，包括基因組、轉錄組、表觀遺傳學等方面，可以精確分析每一個細胞的變化，同時隨著測序技術的提升，基因表達量的獲取也越來越多，廣泛應用于各個方面。ScRNA-seq的步驟大致包括：分離單細胞、制備乳濁液、破乳、擴增序列、測序及分析[6]。

ScRNA-seq首先需要制備細胞懸浮液，之后進行細胞計數和細胞活率檢測，將制備好的細胞懸浮液利用微流控芯片，將帶有細胞標簽序列（cell barcode）的膠珠（bead）和細胞包裹在液滴中，構成了油包水的結構，將細胞裂解，使得細胞中的mRNA與bead上面的cell barcode相連，形成Single Cell GEMs（Gel Bead-in-Emulsions），在液滴中進行逆轉錄反應，進行cDNA的文庫構建。

通過文庫序列上的cell barcode可以區分目標序列來自哪一個細胞，通過序列上的UMI可以區分來源于哪個DNA分子。scRNA-seq的測序信息能反映出細胞間基因表達差異。通過特殊barcodes對同一個細胞的轉錄本進行標記，使得擴增之后也可以準確區分每一個細胞的單細胞信息。UMI標記每一個細胞當中的每一個轉錄本，每個DNA分子都有自己的UMI序列，一個UMI對應了一種DNA，在PCR擴增的時候產生的多個reads兼并成一個原始的cDNA分子，可以在很大程度上糾正擴增造成的結果偏倚[7]。

ScRNA-seq獲得每一個細胞的表達量信息之后需要進行質控，目的是去除不合理的測序細胞。

（1）低質量的細胞或空的液滴中含有基因較少。

（2）細胞雙重態或多重態檢測到異常高基因。

（3）線粒體基因占比較高的細胞。

質控后的數據進行主成分分析（PCA），根據主成分結果選擇細胞類群；通過細胞的markgene對細胞進行聚類分析和細胞類別的鑒定，不同樣本的對比分析，可以實現細胞異質性研究，即使不同類群的細胞也可以在同一層面進行研究，從單細胞水平獲得基因的表達譜，揭示特定的生物學過程和疾病發生過程的分子調節機制[8]。

3 單細胞測序技術在研究腫瘤的發生發展及腫瘤微環境方面的優勢

3.1 研究腫瘤的異質性，探討腫瘤發生發展規律

Wu等通過對42個晚期非小細胞肺癌腫瘤活組織進行scRNA-seq，鑒定出以往研究不同的細胞類型，例如濾泡樹突狀細胞和輔助性T細胞17細胞，來自不同患者的腫瘤組織在細胞組成、染色體結構、發育軌跡方面具有較大的異質性，同時揭示了異質性與腫瘤相關嗜中性粒細胞的關系[9]。為了研究乳腺癌原位腫瘤組織和轉移腫瘤組織中腫瘤細胞拷貝數變異（CNV）差異，Gao等應用單細胞測序技術發現大量的CNA在腫瘤進化的早期短時間內獲得，并且隨著腫瘤克隆擴張而保持高度穩定，克隆多樣化發生在腫瘤進展的最早階段，產生一個或多個克隆穩定擴增，符合“大爆炸”模型；同時揭示了乳腺癌的發展過程，轉移灶是經過淋巴和血道轉移形成的[10-11]。

3.2 描述腫瘤免疫微環境，尋找免疫治療靶點

ScRNA-seq全面地展現了腫瘤微環境中各組成部分的特有特征，并明確腫瘤細胞與微環境各組分之間的相互作用，尤其是腫瘤與免疫細胞的關系，有助于探索腫瘤免疫治療的潛在新靶點。腫瘤相關巨噬細胞、肥大細胞、T淋巴細胞、B淋巴細胞、自然殺傷細胞等細胞亞群構成了腫瘤免疫微環境；這些免疫細胞不僅發揮著腫瘤細胞的殺傷作用，同時又促進腫瘤進展、免疫逃逸[12]。抗體阻滯細胞毒性T淋巴細胞相關抗原-4（CTLA-4）、程序性死亡受體-1（PD-1）等免疫治療的藥物就是解除CD8+T細胞免疫抑制的靶向藥物，黑色素瘤、淋巴瘤、Merkel細胞癌等腫瘤對靶向治療藥物反應良好，但是對有些腫瘤效果不佳，如卵巢癌、胰腺癌等，我們還需要進一步對腫瘤的免疫微環境進行研究，找到每個腫瘤特異的治療靶點。為了解肝癌患者腫瘤微環境的特征，Zheng等對5063個人類肝癌T細胞進行了scRNA-seq，通過轉錄組數據進行細胞分類，發現了大量功能紊亂的殺傷性CD8+T細胞和抑制性T細胞存在于腫瘤細胞內，同時基因Layilin對CD8+T細胞的殺傷功能有抑制作用，可能成為潛在免疫治療靶點[13]。

3.3 突破樣本量的限制，實現信息最大化

ScRNA-seq可以突破樣本量的限制，如超聲引導下穿刺樣本、外周血循環腫瘤細胞等都是應用最小的樣本實現最大化。外周血循環腫瘤細胞（CTCs）是從原發或繼發腫瘤病灶脫落進入外周血的腫瘤細胞[14]。有觀點認為其具有在遠處器官啟動腫瘤生長的能力，傳統的方法無法實現對脫落腫瘤細胞的研究，而單細胞水平的研究可以實現。D_Avola等通過單細胞測序檢測到肝癌患者血液中的CTCs，CTCs中表達的基因[長非編碼RNA（HULC）、SPINK1，IGF2]是肝癌中的特異基因，也說明其來源于肝癌組織；CTCs高表達IGF2，20% 的早期肝癌患者也高表達IGF2。該研究基于單細胞技術對肝癌患者CTCs的研究，發現了潛在生物標志物IGF2，為肝癌患者的診斷提供參考[15]。

4 展望

HB是一種原發于肝臟的實體惡性腫瘤，近年來發病率有所增加。目前的主要治療方法包括化學療法、手術切除和肝移植，高危患兒的預后不佳。目前尚缺乏有效的免疫及靶向治療方案，對于腫瘤的發生發展過程以及免疫機制等都不太清楚。ScRNA-seq作為一項細胞水平的技術，可以實現腫瘤異質性的研究以及腫瘤微環境的探索，其在實體腫瘤中的廣泛應用證明了研究前景，應用此項技術研究HB是可行的，將來我們可能找到精準的免疫及靶向治療方案，為HB患兒帶去希望。