一株罕見的薩奧沙門氏菌的分離鑒定

李海遙

（江陽區(qū)疾病預(yù)防控制中心，四川瀘州 646000）

四川省瀘州市江陽區(qū)位于四川省東南端，全區(qū)面積600多平方公里，常住人口70余萬人，屬亞熱帶濕潤性季風(fēng)氣候，氣溫適宜各種微生物生長，食物中毒時有發(fā)生，又尤其以夏秋季節(jié)為高發(fā)。食物中毒分化學(xué)性食物中毒和細(xì)菌性食物中毒，江陽區(qū)化學(xué)性食物中毒以食用亞硝酸鹽和化兒草中毒為主，細(xì)菌性食物中毒發(fā)生過由沙門氏菌、肉毒梭菌、副溶血性弧菌引起的食物中毒，其中又以沙門氏菌引起的食物中毒最常見。本次分離出的薩奧沙門氏菌源于一次疑似食物中毒事件的致病菌分離，江陽區(qū)疾病預(yù)防控制中心接到市民投訴后，采集了餐廳剩余食品、食品加工工具和相關(guān)食客、餐廳員工的大便或肛拭子標(biāo)本，所有樣本經(jīng)過實驗室致病菌分離培養(yǎng)、鑒定，除餐廳廚師肛拭子檢出薩奧沙門氏菌外，其余均未檢出相關(guān)致病菌。現(xiàn)將薩奧沙門氏菌分離鑒定過程詳述如下。

1 材料與方法

1.1 儀器和試劑

BHC-1300IIA/B3生物安全柜（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）、LS-75HD立式壓力蒸汽滅菌器（江陰濱江醫(yī)療設(shè)備有限公司）、YP802N電子天平（上海精密科學(xué)儀器有限公司）、SPX-330低溫培養(yǎng)箱（常州恒隆儀器有限公司）、SPX-205-III生化培養(yǎng)箱（常州恒隆儀器有限公司）及XH-B漩渦混勻器（江蘇康健醫(yī)療用品有限公司）。

緩沖蛋白胨水（BPW）、亞硒酸鹽胱氨酸增菌液（SC）、四硫磺酸鹽煌綠增菌液基礎(chǔ)（TTB）、SS瓊脂、亞硫酸鉍瓊脂（BS）、沙門氏菌顯色培養(yǎng)基（第二代）、三糖鐵瓊脂（TSI）、營養(yǎng)瓊脂（NA）、腦心浸出液（BHI）及博檢革蘭氏陰性細(xì)菌鑒定系統(tǒng)，均購于青島海博生物技術(shù)有限公司，沙門氏菌屬60種診斷血清購于寧波天潤生物藥業(yè)有限公司。

1.2 樣本采集

因其他樣本未檢出相關(guān)致病菌，在此不再詳述。肛拭子采集：將無菌棉簽插入被采集人直腸5 cm左右，旋轉(zhuǎn)360°取出放入10 mL生理鹽水管備用[1]。

1.3 分離鑒定方法

1.3.1 增菌培養(yǎng)

將含肛拭子的生理鹽水管漩渦混勻，分別吸取 1 mL混勻液接種到10 mL亞硒酸鹽胱氨酸增菌液（SC）和10 mL四硫磺酸鹽煌綠增菌液（TTB）中，接種后的亞硒酸鹽胱氨酸增菌液（SC）于36 ℃培養(yǎng)24 h， 四硫磺酸鹽煌綠增菌液（TTB）于42 ℃培養(yǎng)24 h[2]。

1.3.2 分離培養(yǎng)

將培養(yǎng)后的亞硒酸鹽胱氨酸增菌液（SC）和四硫磺酸鹽煌綠增菌液（TTB）分別劃線接種亞硫酸鉍瓊脂（BS）平板、沙門氏菌顯色平板和SS瓊脂平板，亞硫酸鉍瓊脂（BS）平板于36 ℃培養(yǎng)48 h，沙門氏菌顯色平板和SS瓊脂平板于36 ℃培養(yǎng)24 h。將可疑菌落接種三糖鐵瓊脂管，同時接種營養(yǎng)瓊脂平板純培養(yǎng)，于36 ℃培養(yǎng)24 h。

1.3.3 生化鑒定

將營養(yǎng)瓊脂平板上的菌落染色鏡檢，確定為革蘭陰性菌，將剩余菌落挑至無菌生理鹽水管中制成適當(dāng)濃度菌懸液，接種博檢革蘭氏陰性細(xì)菌鑒定系統(tǒng)，于36 ℃培養(yǎng)24 h。

1.3.4 血清型鑒定

挑取適量營養(yǎng)瓊脂平板上的菌落與生理鹽水研開混勻，排除自凝后，用沙門氏多價O血清凝集，凝集后，再分別用單價和復(fù)合O血清凝集，因?qū)幉ㄌ鞚櫳抽T氏菌屬60種診斷血清未包含O1血清，所以O(shè)1血清凝集未做，再用對應(yīng)H血清凝集。

2 結(jié)果與分析

根據(jù)血清凝集結(jié)果，查閱沙門氏菌屬抗原表，得知其為E4群沙門氏菌中的薩奧沙門氏菌。

2.1 菌落形態(tài)鑒定結(jié)果

經(jīng)培養(yǎng)后，從亞硒酸鹽胱氨酸增菌液（SC）轉(zhuǎn)種的平板發(fā)現(xiàn)可疑沙門氏菌菌落，在亞硫酸鉍瓊脂（BS）平板上為棕褐色菌落，菌落周圍培養(yǎng)基呈棕色；在沙門氏菌顯色平板上為紫色菌落；在SS瓊脂平板上為中心黑色、邊緣透明、直徑2 mm左右的菌落，菌落圖片見圖1。可疑菌落接種培養(yǎng)后三糖鐵斜面呈紅色，底層黃色，產(chǎn)氣，產(chǎn)硫化氫，三糖鐵瓊脂管結(jié)果見圖2。

圖1 在SS瓊脂平板上的菌落形態(tài)圖

圖2 在三糖鐵瓊脂管上的生長反應(yīng)圖

2.2 生化鑒定結(jié)果

按1.3.3步驟操作，培養(yǎng)后讀取結(jié)果如表1所示。

表1 可疑典型沙門氏菌生化鑒定結(jié)果

2.3 血清型鑒定結(jié)果

按1.3.4步驟操作，凝集后確定血清型為e:3，19、h、n、z15。

3 結(jié)論

此次菌株分離在標(biāo)準(zhǔn)方法上加用了SS瓊脂平板，此種平板歷來在江陽區(qū)疾病預(yù)防控制中心分離沙門氏菌和志賀氏菌中使用，培養(yǎng)基價格便宜，易于配制，且沙門氏菌和志賀氏菌在SS瓊脂平板上菌落典型，易于觀察，建議有條件的實驗室加用。另外，疾控中心外出采樣人員，可以隨身攜帶SS平板，以方便采樣后立即劃線接種平板，接種后的平板帶回實驗室后需立即放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)24 h后便可初步了解沙門氏菌和志賀氏菌感染情況，若有可疑菌落生長，即可進(jìn)行純培養(yǎng)和后續(xù)生化鑒定及血清學(xué)凝集試驗，這就大大提前了國標(biāo)方法上的沙門氏菌和志賀氏菌的檢出時間[3]。當(dāng)然，因食物中毒事件比較特殊，需要快速找出致病因子，因此此法可作為食物中毒事件中沙門氏菌和志賀氏菌分離培養(yǎng)的快速篩查方法，但在此法進(jìn)行的同時，國標(biāo)方法需同步進(jìn)行，以便對快速分離出的致病菌進(jìn)行印證。

沙門氏菌血清凝集試驗較煩瑣，特別是雙相菌只檢出其中一相鞭毛抗原，另一相經(jīng)常需要誘導(dǎo)才能凝出結(jié)果。誘導(dǎo)方法較多，如國標(biāo)方法、改良半固體RV培養(yǎng)基誘導(dǎo)法[4]等。江陽區(qū)疾病預(yù)防控制中心實驗室參考國標(biāo)方法，常用的誘導(dǎo)方法如下：取營養(yǎng)瓊脂和腦心浸出液（BHI）各一半用蒸餾水配制成混合物，經(jīng)高壓滅菌后傾倒成平板，放培養(yǎng)箱里孵干表面水分，在平板上滴幾小滴已經(jīng)凝出的第一相血清，用接種環(huán)挑取少量需誘導(dǎo)的菌落接種在血清中心，蓋上平板放培養(yǎng)箱中36 ℃培養(yǎng)18～24 h，培養(yǎng)后挑取蔓延生長的菌苔邊緣做另一相血清凝集，若仍不能誘導(dǎo)出鞭毛抗原，則繼續(xù)取菌苔邊緣菌落重復(fù)實驗，一般兩次即可誘導(dǎo)出另一相鞭毛抗原。若此法2～3次均不能誘導(dǎo)出第二相鞭毛抗原，則需更換誘導(dǎo)方法，以防菌落變?yōu)榇植谛途涑霈F(xiàn)假凝集。另一種位相變異方法所用培養(yǎng)基為Swarm瓊脂，此瓊脂專用于沙門氏菌H相抗原誘導(dǎo)試驗，此方法與上一方法比較大同小異，但是此法可用制動試驗印證誘導(dǎo)實驗結(jié)果，較上一方法更準(zhǔn)確。

沙門氏菌為江陽區(qū)常見的食物中毒病原體，因此在預(yù)防方面尤其重要。本次接報的食物中毒事件雖然廚師肛拭子檢出薩奧沙門氏菌，但餐廳剩余食物、餐廳食品加工工具以及有疑似食物中毒癥狀的所有食客均未檢出病原菌，因此沒有充分的證據(jù)判定此次事件為食物中毒事件[5]。當(dāng)然，江陽區(qū)疾病預(yù)防控制中心本次肛拭子采樣是把采樣后的拭子放入10 mL無菌生理鹽水管中，生理鹽水對樣本存在稀釋可能，為避免這種情況，采樣盡可能采集大便樣本，或采集后的肛拭子直接放入相應(yīng)增菌液中進(jìn)入檢測程序。本次事件中，廚師無發(fā)熱、腹瀉、嘔吐等沙門氏菌感染引起的癥狀，經(jīng)查閱文獻(xiàn)，發(fā)現(xiàn)1984年河北省石家莊市衛(wèi)生防疫站在飲食行業(yè)健康人員便檢普查中曾分離出過此種沙門氏菌[6]，因此健康人群攜帶薩奧沙門氏菌是否發(fā)病、是否會傳染他人還有待研究。目前，國家對從業(yè)人員的健康監(jiān)控政策是每年進(jìn)行一次預(yù)防性健康檢查，體檢項目中包含大便或肛拭子中沙門氏菌的檢測，這就杜絕了攜帶沙門氏菌而不發(fā)病人員從事食品相關(guān)工作而傳染他人。對于承擔(dān)健康體檢工作的醫(yī)療機(jī)構(gòu)來說，就尤其要注意此類型標(biāo)本的檢測，以防漏檢造成大面積的傳播。