一株罕見的薩奧沙門氏菌的分離鑒定

李海遙

（江陽區疾病預防控制中心，四川瀘州 646000）

四川省瀘州市江陽區位于四川省東南端，全區面積600多平方公里，常住人口70余萬人，屬亞熱帶濕潤性季風氣候，氣溫適宜各種微生物生長，食物中毒時有發生，又尤其以夏秋季節為高發。食物中毒分化學性食物中毒和細菌性食物中毒，江陽區化學性食物中毒以食用亞硝酸鹽和化兒草中毒為主，細菌性食物中毒發生過由沙門氏菌、肉毒梭菌、副溶血性弧菌引起的食物中毒，其中又以沙門氏菌引起的食物中毒最常見。本次分離出的薩奧沙門氏菌源于一次疑似食物中毒事件的致病菌分離，江陽區疾病預防控制中心接到市民投訴后，采集了餐廳剩余食品、食品加工工具和相關食客、餐廳員工的大便或肛拭子標本，所有樣本經過實驗室致病菌分離培養、鑒定，除餐廳廚師肛拭子檢出薩奧沙門氏菌外，其余均未檢出相關致病菌。現將薩奧沙門氏菌分離鑒定過程詳述如下。

1 材料與方法

1.1 儀器和試劑

BHC-1300IIA/B3生物安全柜（蘇州安泰空氣技術有限公司）、LS-75HD立式壓力蒸汽滅菌器（江陰濱江醫療設備有限公司）、YP802N電子天平（上海精密科學儀器有限公司）、SPX-330低溫培養箱（常州恒隆儀器有限公司）、SPX-205-III生化培養箱（常州恒隆儀器有限公司）及XH-B漩渦混勻器（江蘇康健醫療用品有限公司）。

緩沖蛋白胨水（BPW）、亞硒酸鹽胱氨酸增菌液（SC）、四硫磺酸鹽煌綠增菌液基礎（TTB）、SS瓊脂、亞硫酸鉍瓊脂（BS）、沙門氏菌顯色培養基（第二代）、三糖鐵瓊脂（TSI）、營養瓊脂（NA）、腦心浸出液（BHI）及博檢革蘭氏陰性細菌鑒定系統，均購于青島海博生物技術有限公司，沙門氏菌屬60種診斷血清購于寧波天潤生物藥業有限公司。

1.2 樣本采集

因其他樣本未檢出相關致病菌，在此不再詳述。肛拭子采集：將無菌棉簽插入被采集人直腸5 cm左右，旋轉360°取出放入10 mL生理鹽水管備用[1]。

1.3 分離鑒定方法

1.3.1 增菌培養

將含肛拭子的生理鹽水管漩渦混勻，分別吸取 1 mL混勻液接種到10 mL亞硒酸鹽胱氨酸增菌液（SC）和10 mL四硫磺酸鹽煌綠增菌液（TTB）中，接種后的亞硒酸鹽胱氨酸增菌液（SC）于36 ℃培養24 h， 四硫磺酸鹽煌綠增菌液（TTB）于42 ℃培養24 h[2]。

1.3.2 分離培養

將培養后的亞硒酸鹽胱氨酸增菌液（SC）和四硫磺酸鹽煌綠增菌液（TTB）分別劃線接種亞硫酸鉍瓊脂（BS）平板、沙門氏菌顯色平板和SS瓊脂平板，亞硫酸鉍瓊脂（BS）平板于36 ℃培養48 h，沙門氏菌顯色平板和SS瓊脂平板于36 ℃培養24 h。將可疑菌落接種三糖鐵瓊脂管，同時接種營養瓊脂平板純培養，于36 ℃培養24 h。

1.3.3 生化鑒定

將營養瓊脂平板上的菌落染色鏡檢，確定為革蘭陰性菌，將剩余菌落挑至無菌生理鹽水管中制成適當濃度菌懸液，接種博檢革蘭氏陰性細菌鑒定系統，于36 ℃培養24 h。

1.3.4 血清型鑒定

挑取適量營養瓊脂平板上的菌落與生理鹽水研開混勻，排除自凝后，用沙門氏多價O血清凝集，凝集后，再分別用單價和復合O血清凝集，因寧波天潤沙門氏菌屬60種診斷血清未包含O1血清，所以O1血清凝集未做，再用對應H血清凝集。

2 結果與分析

根據血清凝集結果，查閱沙門氏菌屬抗原表，得知其為E4群沙門氏菌中的薩奧沙門氏菌。

2.1 菌落形態鑒定結果

經培養后，從亞硒酸鹽胱氨酸增菌液（SC）轉種的平板發現可疑沙門氏菌菌落，在亞硫酸鉍瓊脂（BS）平板上為棕褐色菌落，菌落周圍培養基呈棕色；在沙門氏菌顯色平板上為紫色菌落；在SS瓊脂平板上為中心黑色、邊緣透明、直徑2 mm左右的菌落，菌落圖片見圖1。可疑菌落接種培養后三糖鐵斜面呈紅色，底層黃色，產氣，產硫化氫，三糖鐵瓊脂管結果見圖2。

圖1 在SS瓊脂平板上的菌落形態圖

圖2 在三糖鐵瓊脂管上的生長反應圖

2.2 生化鑒定結果

按1.3.3步驟操作，培養后讀取結果如表1所示。

表1 可疑典型沙門氏菌生化鑒定結果

2.3 血清型鑒定結果

按1.3.4步驟操作，凝集后確定血清型為e:3，19、h、n、z15。

3 結論

此次菌株分離在標準方法上加用了SS瓊脂平板，此種平板歷來在江陽區疾病預防控制中心分離沙門氏菌和志賀氏菌中使用，培養基價格便宜，易于配制，且沙門氏菌和志賀氏菌在SS瓊脂平板上菌落典型，易于觀察，建議有條件的實驗室加用。另外，疾控中心外出采樣人員，可以隨身攜帶SS平板，以方便采樣后立即劃線接種平板，接種后的平板帶回實驗室后需立即放入培養箱中培養，培養24 h后便可初步了解沙門氏菌和志賀氏菌感染情況，若有可疑菌落生長，即可進行純培養和后續生化鑒定及血清學凝集試驗，這就大大提前了國標方法上的沙門氏菌和志賀氏菌的檢出時間[3]。當然，因食物中毒事件比較特殊，需要快速找出致病因子，因此此法可作為食物中毒事件中沙門氏菌和志賀氏菌分離培養的快速篩查方法，但在此法進行的同時，國標方法需同步進行，以便對快速分離出的致病菌進行印證。

沙門氏菌血清凝集試驗較煩瑣，特別是雙相菌只檢出其中一相鞭毛抗原，另一相經常需要誘導才能凝出結果。誘導方法較多，如國標方法、改良半固體RV培養基誘導法[4]等。江陽區疾病預防控制中心實驗室參考國標方法，常用的誘導方法如下：取營養瓊脂和腦心浸出液（BHI）各一半用蒸餾水配制成混合物，經高壓滅菌后傾倒成平板，放培養箱里孵干表面水分，在平板上滴幾小滴已經凝出的第一相血清，用接種環挑取少量需誘導的菌落接種在血清中心，蓋上平板放培養箱中36 ℃培養18～24 h，培養后挑取蔓延生長的菌苔邊緣做另一相血清凝集，若仍不能誘導出鞭毛抗原，則繼續取菌苔邊緣菌落重復實驗，一般兩次即可誘導出另一相鞭毛抗原。若此法2～3次均不能誘導出第二相鞭毛抗原，則需更換誘導方法，以防菌落變為粗糙型菌落出現假凝集。另一種位相變異方法所用培養基為Swarm瓊脂，此瓊脂專用于沙門氏菌H相抗原誘導試驗，此方法與上一方法比較大同小異，但是此法可用制動試驗印證誘導實驗結果，較上一方法更準確。

沙門氏菌為江陽區常見的食物中毒病原體，因此在預防方面尤其重要。本次接報的食物中毒事件雖然廚師肛拭子檢出薩奧沙門氏菌，但餐廳剩余食物、餐廳食品加工工具以及有疑似食物中毒癥狀的所有食客均未檢出病原菌，因此沒有充分的證據判定此次事件為食物中毒事件[5]。當然，江陽區疾病預防控制中心本次肛拭子采樣是把采樣后的拭子放入10 mL無菌生理鹽水管中，生理鹽水對樣本存在稀釋可能，為避免這種情況，采樣盡可能采集大便樣本，或采集后的肛拭子直接放入相應增菌液中進入檢測程序。本次事件中，廚師無發熱、腹瀉、嘔吐等沙門氏菌感染引起的癥狀，經查閱文獻，發現1984年河北省石家莊市衛生防疫站在飲食行業健康人員便檢普查中曾分離出過此種沙門氏菌[6]，因此健康人群攜帶薩奧沙門氏菌是否發病、是否會傳染他人還有待研究。目前，國家對從業人員的健康監控政策是每年進行一次預防性健康檢查，體檢項目中包含大便或肛拭子中沙門氏菌的檢測，這就杜絕了攜帶沙門氏菌而不發病人員從事食品相關工作而傳染他人。對于承擔健康體檢工作的醫療機構來說，就尤其要注意此類型標本的檢測，以防漏檢造成大面積的傳播。