60Co-γ射線輻射對金花菜種子生物學效應的影響

陳莉敏 李達旭,* 白史且 張 玉 毛德才 廖興勇 楊曉玲

(1 四川省草原科學研究院，四川 成都 611731；2 四川省林業和草原局，四川 成都 610081；3 成都市農林科學院，四川 成都 611134；4 成都市龍泉驛區第一人民醫院，四川 成都 610100)

金花菜(MedicagopolymorphaL., bur clover)，又稱草頭[1]、南苜蓿[2]、肥田草等，屬豆科(Leguminosae)苜蓿屬(Midicago)一年生或越年生植物[3]，原產于地中海地區，廣泛分布于歐洲、亞洲和非洲北部，在我國主要生長在長江流域以南，常為栽培或半野生狀態，適應性良好[4]。金花菜生長迅速、營養豐富，蛋白質含量可達25%以上[5]，氨基酸、維生素、礦物質、微量元素豐富[6]，具有菜用、飼用、藥用、綠肥、邊坡綠化等多種用途。國外金花菜品種有Santiago、Serena、Scimitar、Cavalier、Armadillo[3]和Anglona[7]等，但均未引入國內；我國現有淮揚金花菜[8]、楚雄南苜蓿[9]、川南金花菜[3]3個品種，均為菜用和飼用品種。農民可選擇的品種不多，藥用或具有抗逆特性的新品種研發進展緩慢，育種途徑較為單一，種質資源的匱乏限制了金花菜的育種及利用。利用現代育種技術開展金花菜育種研究，創制具有優良性狀或抗逆特性的新材料，對豐富金花菜種質資源多樣性，滿足農業生產需求具有積極的作用。

輻射育種是核技術農業應用的重要領域。利用放射性同位素放出的射線(如α射線、γ射線)照射農作物種子、植株或其他器官，使種子或植株發生遺傳變異，再經過人工選種和培育，得到新的優良品種[10]。目前，輻射誘變育種在植物突變品種培育和新資源創制等領域得到了廣泛應用[11]。60Co-γ射線輻射是植物誘變育種的常用方法，具有控制輻射條件便利、試驗重演性好、育種效果良好等特點[12]，但仍鮮見有關金花菜輻射育種的相關研究。鑒于此，本研究以川南金花菜種子為材料，利用不同劑量的60Co-γ射線輻射金花菜種子，旨在了解60Co-γ射線對金花菜種子萌發和植株生長的影響，確定60Co-γ射線輻射金花菜的適宜劑量，為金花菜輻射育種提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料為精選川南金花菜干種子，由四川省草原科學研究院提供。

1.2 試驗方法

1.2.1 種子輻射 2019年9月，將金花菜干種子送至四川省農業科學院輻射場進行60Co-γ射線輻射處理，輻射劑量為0(對照)、400、600、800、1 000、1 200 Gy，劑量率為2 Gy·min-1，每個處理共300粒，重復3次。

1.2.2 種子萌發效應 將輻射處理的種子進行表面消毒，采用培養皿濾紙發芽法，將種子均勻平鋪于帶有3層濕潤濾紙的培養皿上，每皿50粒，重復3次，放置于恒溫培養箱中25±2℃培養，觀察種子14 d內發芽情況。

1.2.3 植株生長效應 將種子播種于育苗盤(540 mm×280 mm，32孔，每孔110 mL)中，每個處理播種96孔，每孔1粒，放置于四川省草原科學研究院成都市大邑縣韓場鎮實驗基地進行田間培養，每天澆水1次，觀察植株出苗和生長情況。幼苗生長2個月后，統計幼苗存活率。生長第3個月進入分枝期，每個處理隨機選擇5株，測定株高和分枝數。2020年3月6日—4月18日植株進入花期和結莢期，每個處理固定選擇5株，每周記錄株高、開花數量、結莢數量。4月19日—20日采收莢果。

1.2.4 輻射半致死劑量的確定 參考已有研究方法[13-14]，以金花菜種子在不同輻射劑量下幼苗的存活率為縱坐標(y)，輻射劑量為橫坐標(x)，擬合直線回歸方程y=a+bx，計算存活率為50%時對應的輻射劑量，得到金花菜種子輻射的半致死劑量(the semi-lethal dose, LD50)。

1.3 分析方法

采用Excel 2007統計數據和作圖，采用SPSS 22.0分析試驗結果，對金花菜種子萌發率和植株生長指標數據采用單因素方差分析，對金花菜開花和結莢數量采用重復測量分析。

2 結果與分析

2.1 60Co-γ射線輻射對金花菜種子萌發的影響

由圖1可知，金花菜在發芽7 d內發芽迅速，在10～14 d發芽速度變慢，經60Co-γ射線輻射的種子發芽速度和發芽率均高于對照組(0 Gy)。在發芽第14天，5個處理組(400～1 200 Gy)的種子發芽率分別為89.58%、76.56%、73.96%、70.83%和64.06%，均高于對照組(62.5%)。400 Gy處理組的發芽率顯著高于對照組和1 000、1 200 Gy處理組(P<0.05)，發芽率隨著輻射劑量從400 Gy增加到1 200 Gy而逐漸降低。

2.2 60Co-γ射線輻射對金花菜幼苗生長的影響及半致死劑量(LD50)的確定

幼苗經過2個月的生長，不同輻射劑量的幼苗生長情況不同(圖2)。觀察發現，高劑量輻射的種子出現不發芽或部分種子發芽后真葉發育受到抑制的現象；高劑量輻射存活的植株矮??；輻射植株葉片出現花葉、復葉增加1～2片、葉片畸形的現象，但無明顯規律。

對存活率的統計發現(表1)，對照組和2個低劑量組(400、600 Gy)的金花菜幼苗存活率分別為69.79%、69.27%和71.88%，高劑量組(800～1 200 Gy)的存活率分別是21.88%、20.31%、19.27%，低劑量組的幼苗存活率顯著高于高劑量組。存活率和輻射劑量的線性回歸方程為y=-0.0534x+80.992(R2=0.713)，將成活率50%代入方程，計算得出金花菜種子輻射的LD50為580 Gy。

幼苗株高的結果分析顯示，各處理(0～1 200 Gy)幼苗平均株高分別為10.45、9.41、9.10、7.33、6.67、6.06 cm，對照組幼苗株高最高，對照組和低劑量組的幼苗株高顯著高于高劑量組。

對分枝數的統計結果顯示，對照組和400 Gy處理組的分枝數分別為4.50和5.30，高于其他處理，二者間無顯著性差異，分枝數隨著輻射劑量的增加而減少。

2.3 輻射劑量與生長指標相關性分析

相關性分析結果顯示(表2)，輻射劑量與幼苗存活率、株高和分枝數均呈極顯著負相關，相關性系數分別為-0.815、-0.704、-0.504。株高與分枝數和存活率存在顯著正相關關系，相關性系數分別為0.416和0.805，發芽率與分枝數、存活率為正相關關系，相關性系數分別為0.323和0.338，但無顯著性。

圖2 不同輻射劑量對金花菜生長的影響(分枝期)Fig.2 Effect of different radiation doses on the growth of bur clover(branching period)

表1 60Co-γ輻射對金花菜幼苗生長影響Table 1 Effect of 60Co-γ radiation treatments on the seedling growth of bur clover

表2 相關性分析Table 2 Correlation analysis

2.4 60Co-γ射線輻射對金花菜開花和結莢的影響

金花菜多在秋季種植，一般在次年3月初開花，整個花期持續約40 d，邊開花邊結果，一般在植株距離地面1/3處莢果變黑時整株采收種子。

重復測量分析結果顯示，時間和輻射劑量均對開花數量有顯著性影響(P<0.05)，且時間和輻射劑量存在顯著交互作用。由表3可知，除800 Gy處理組外，其他處理植株的開花數量均在第2次記錄時(D7，即3月14日)達到最大值，0～1 200 Gy的開花數量分別達到484、548、587、287、568、493，D14后開花數量逐漸下降；到最后一次記錄時(D42，即4月18日)，對照組、800 Gy、1 000 Gy和1 200 Gy處理組植株開花數量均為0，400 Gy和600 Gy處理組開花數量分別為46和94。400 Gy和600 Gy處理組金花菜開花數量在整個花期均高于對照，600 Gy處理組金花菜開花數量在第7～第28天為最高。

對結莢數量的重復測量分析結果顯示，時間和輻射劑量對結莢數量影響顯著(P<0.05)，且時間和輻射劑量存在顯著交互作用。由表4可知，各處理結莢數量隨著時間逐漸增加，D35時，0～1 200 Gy各處理的結莢數量分別達到為508、547、588、420、438、423，低劑量(0～600 Gy)結莢數量相對較高，但差異不顯著；最后一次記錄(D42)顯示，400～800 Gy處理組結莢數量分別為577、648和485，對照組、1 000 Gy和1 200 Gy處理組莢果全部掉落，高劑量組植株比低劑量組提前一周枯黃。

表3 不同輻射劑量對金花菜開花數量的影響Table 3 Effect of different radiation treatments on flowers number of bur clover

表4 不同輻射劑量處理對金花菜結莢數量的影響Table 4 The effect of different radiation treatments on pods number of bur clover

3 討論

輻射誘變選育新牧草品種能提高變異頻率、加速育種過程、獲得某些優良性狀[15]，可以用于培育高產、優質、抗逆性強的草類植物新品種。低毒小冠花新品系、科輻系特早熟沙打旺(科輻一號、科輻二號、科輻六號)都是牧草輻射誘變育種取得的優良突變材料[16]，Tift-Eagle狗牙根和Tift-94狗牙根是草坪草輻射誘變育種的代表品種[17]，這些品種的推廣應用效果良好，推動了草業相關育種研究的發展。

耿興敏等[18]利用0～250 Gy的60Co-γ輻射不同品種的桂花種子，發現60Co-γ輻射劑量總體上與桂花種子發芽率呈負相關關系；李波等[19]利用600～1 800 Gy對苜蓿種子輻射，發現苜蓿種子的發芽率、發芽指數和發芽勢均隨輻射劑量的增加呈下降趨勢。本試驗中，輻射劑量和發芽率整體上為負相關關系，這與前人研究結果一致，但并未達到顯著相關水平；與前人研究不同的是金花菜種子發芽率呈現出先升后降的規律，輻射處理的種子發芽率均高于對照，說明一定劑量范圍的60Co-γ輻射能提高種子發芽率。

本研究結果顯示，輻射劑量與幼苗存活率、株高、分枝數均為顯著負相關。劉友接等[20]、李秀芬等[21]、劉春貴等[22]都認為低劑量輻射可以提高植物種子發芽率和存活率；Beyaz[23]研究發現低劑量輻射還可以提高幼苗對鹽和干旱脅迫的耐受性，高劑量輻射抑制發芽，對植株生長不利。本研究結果與前人研究結果相一致，但劑量不同，Beyaz對箭筈豌豆的低輻射劑量界定在100 Gy以內，本研究金花菜的低劑量輻射在600 Gy以內。具體而言，400 Gy對金花菜幼苗存活率、株高和分枝數都有較好的促進作用，600 Gy對幼苗存活率和株高也有較好促進作用，超過600 Gy的輻射劑量降低了金花菜幼苗存成活率，導幼苗致植株矮小，分枝數減少，甚至出現真葉枯黃、植株死亡等現象，呈現顯著的抑制作用，說明低劑量(≤600 Gy)輻射促進金花菜生長，而高劑量(>600 Gy)對金花菜生長的抑制作用明顯。

前人關于水果和花卉育種應用的研究發現60Co-γ輻射會造成開花時間推遲、花色變化[24]，改變莢果形態、產量、顏色等性狀[25]。本試驗未發現花色、莢果形態和顏色的明顯變化，但由金花菜開花數量和結莢數量的變化趨勢可知，輻射對金花菜開花和結莢數量有影響，600 Gy的輻射量可提高開花、結莢數量，超過600 Gy的輻射量對開花和結莢的抑制作用明顯。

60Co-γ射線可能抑制植株生長或引起植株死亡[26]，在誘變育種中，LD50是輻射適宜劑量選擇的依據[27-28]，也是開展大量突變體誘變研究的基礎[29]。不同植物之間、同一植株不同器官間，對60Co-γ輻射的耐受力和反應不同，LD50也不同。相關牧草輻射研究表明，無芒雀麥干種子LD50為100～150 Gy[30]，三葉草種子輻射的LD50為792 Gy[31]，高羊茅種子LD50為100～150 Gy，高羊茅分化苗的LD50為20～25 Gy[32]。本研究以幼苗存活率計算LD50，得到金花菜干種子的LD50為580 Gy，劑量率為2 Gy·min-1。

4 結論

本研究結果表明，60Co-γ輻射對金花菜種子的輻射效應明顯。400 Gy輻射劑量可顯著提高種子發芽率；當輻射劑量低于600 Gy時，輻射能促進金花菜種子萌發、生長和結實；當劑量高于600 Gy時，隨著輻射劑量的增加，植株的生長和結實受到抑制。金花菜種子適宜的LD50為580 Gy，劑量率為2 Gy·min-1。