肺炎克雷伯菌毒力基因與TLR4表達的相關性研究

王鶴鳴，劉 周，王珊珊，唐 偉，周 強

作者單位：安徽醫科大學第二附屬醫院檢驗科，合肥 230601

肺炎克雷伯菌(Klebsiellapneumoniae，KP)是社區獲得性感染和醫院感染最常見的革蘭陰性菌，檢出率分別可達6.8%和6.69%[1]。KP根據毒力特點可分為經典肺炎克雷伯菌(classicK.pneumoniae，cKP)和高毒力肺炎克雷伯菌(hypervirulentK.pneumoniae，hvKP)。hvKP的毒力顯著高于cKP，它可以侵害健康的年輕個體，致死率達3%～32%[2]。目前研究多將莢膜多糖合成相關基因≥2個陽性或鐵載體相關基因≥3個陽性的KP菌株定義為hvKP[3]。肺上皮細胞可以分泌Toll樣受體(Toll like receptors，TLRs)[4]、細胞因子等以應對肺炎克雷伯菌肺炎(K.pneumoniaepneumonia，KPN)。TLRs接收相關微生物配體信號并啟動下游級聯反應，其中TLR4參與介導炎癥反應、氧化應激、誘導細胞凋亡等，但可能引發過度的炎癥反應[5]。該研究擬通過分析臨床菌株毒力基因等流行病學特征，進而闡明hvKP及cKP感染的患者體內或細胞水平TLR4的表達水平及其與臨床預后的差異，為KPN的臨床診斷及治療提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1病例資料 選取2020年10月—2021年10月間安徽醫科大學第二附屬醫院收治的85例KPN患者，并收集同期收治的55例體檢健康者作為對照。收集培養出的KP菌株65株，并收集檢出KP患者的血清與臨床病歷資料。

1.1.2納入標準 符合《中國成人社區獲得性肺炎臨床實踐指南》[6-7]，在痰培養或肺泡灌洗液中檢出KP，外周血檢查:白細胞總數、中性粒細胞以及C反應蛋白(C-reactive protein, CRP)增高；結合患者X線或CT檢查，明確診斷為KPN。

1.1.3實驗儀器及試劑 全自動細菌分析儀(法國Biomerieux公司)；生物安全柜(力新儀器上海有限公司)；細菌多點接種儀(法國Interscience公司)；聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction，PCR)儀器(德國Bi-ometra公司)；凝膠成像儀(北京大龍有限公司)；PCR引物(上海生工生物公司)；酶聯免疫吸附試驗(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)試劑盒(武漢伊萊瑞特生物有限公司)，人肺泡上皮細胞A549來自中國科學院(上海)。

1.2 方法

1.2.1毒力基因檢測 用煮沸法提取各菌株的DNA，采用PCR方法檢測8種毒力基因[8]，包括：①莢膜多糖合成和調控相關基因rmpA1、rmpA2、magA；②鐵載體系統相關基因iucA、kfu、iroN、iroB；③菌毛合成相關基因mrkD[5-6]。毒力基因的引物序列參照表1。各菌株的PCR產物進行凝膠電泳后記錄結果并進行比對。

表1 KP毒力基因的PCR引物序列

1.2.2藥敏試驗 敏感與耐藥判讀參照美國臨床實驗室標準化委員會(Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI)M100-S26文件2018年推出的判讀標準[9]。采用瓊脂平板稀釋法測定菌株對于15種常用抗菌藥物的最低抑菌濃度。

1.2.3ELISA實驗 收集患者外周血清，通過毒力基因檢測將實驗對象分為cKP組與hvKP組，健康體檢者血清作為健康對照組，采用ELISA方法測定兩實驗組及對照組外周血清TLR4的表達水平，檢測過程均嚴格按照試劑盒說明書及儀器操作指南進行。

1.2.4KP侵染A549細胞實驗 A549細胞用含有10%胎牛血清和青霉素-鏈霉素的1640培養基于37 ℃、5%CO2箱中培養。當細胞生長至80%～90%密度時，鋪12孔板，更換為不含雙抗的培養基。

實驗將臨床培養鑒定出的hvKP、cKP兩種菌株，分別于哥倫比亞血瓊脂平板上過夜生長后，刮取單個菌落于LB培養基中，37 ℃溫箱中搖動培養，分光光度計測量600 nm吸光度=0.35，此時細菌處于生長指數期，10 000 r/min離心15min，無菌生理鹽水清洗重懸，通過稀釋涂板法計菌落數量，在A549細胞12孔板中，每孔加入4 μl菌液，測得MOI=100 ∶1。

1.2.5qRT-PCR 在12孔板中使用hvKP、cKP分別侵染A549細胞，設立未感染的空白細胞為對照組，在CO2培養箱中培養6 h后，收集細胞，用TRIzol試劑提取細胞RNA，TLR4引物序列：上游5′-AATCTAGAGCACTTGGACCTTTCC-3′，下游5′-GGGTTCAGGGACAGGTCTAAAGA-3′。在10 μl反應體系中使用1 μl總RNA進行qRT-PCR反應。采用比較閾值循環(CT)方法，通過計算與內參基因GAPDH比值來確定目的基因的表達水平。每組重實驗復3次。

1.2.6臨床嚴重程度及預后評分 根據醫院病歷系統獲取病人基本信息與臨床特征如年齡、體溫、脈搏、呼吸頻率、血壓、PH、血尿素氮、血糖、血鈉、紅細胞比積、氧分壓及相關影像學表現等，根據臨床PSI評分[10]及CURB-65評分[11]對KPN患者進行分級，分析患者血清TLR4水平與臨床肺炎評分之間的相關性。本研究已獲安徽醫科大學第二附屬醫院倫理委員會批準。

2 結果

2.1 毒力基因檢測結果hvKP組中毒力基因陽性率最高的前3種為：kfu(100%)，rmpA1(87.8%)，rmpA2(80.5%)。與cKP組相比，毒力基因有統計學差異的是rmpA1(P=0.000)，rmpA2(P=0.000)，magA(P=0.000)，ironB(P=0.000)。其他基因雖差異無統計學意義，但在hvKP組中的陽性率均高于cKP組(表2)。hvKP及cKP基因電泳條帶結果見圖1。

表2 hvKP和cKP的毒力基因比較[n(%)]

2.2 藥敏實驗結果藥敏結果顯示本院所收集肺炎克雷伯桿菌對替加環素最敏感，敏感率為97.6%；其次是阿米卡星和阿莫西林/克拉維酸，敏感率分別為80.0%及72.9%。在hvKP中對替加環素最敏感，敏感率為95.1%。cKP的頭孢曲松、厄他培南、左氧氟沙星、頭孢哌酮/舒巴坦、哌拉西林/他唑巴坦耐藥性明顯高于hvKP(表3)。

表3 hvKP和cKP的抗生素敏感性比較[n(%)]

圖1 KP毒力基因電泳條帶結果

2.3 ELISA實驗結果通過對KP菌株毒力基因檢測，將收集的臨床血清分為hvKP組及cKP組。血清TLR4的ELISA結果顯示，相比cKP組，hvKP組的血清TLR4水平明顯高于健康對照組(圖2)，差異有統計學意義(P<0.05)。

2.4 qRT-PCR實驗結果qRT-PCR法檢測顯示，相比于空白細胞對照，在hvKP侵染6 h后的A549細胞中，TLR4的mRNA表達水平明顯升高，而在cKP侵染的細胞中TLR4升高不明顯(圖3)，差異有統計學意義(P<0.05)。

2.5 臨床肺炎評分預后分析對KPN患者根據臨床肺炎評分進行分級后，結果顯示患者血清TLR4水平與PSI評分呈正相關性，PSI評分越高的患者，血清TLR4水平也越高(圖4A)；在CURB-65評分中，2分的患者血清TLR4水平高于0～1分的患者(圖4B)，差異有統計學意義(P<0.05)。應用Spearman相關分析表示，血清TLR4水平與PSI、CURB評分均存在正相關關系(r：0.692、0.466；P<0.001)。

圖2 hvKP、cKP感染的患者及健康體檢組血清中TLR4的表達量

圖3 TLR4在mRNA水平上的表達

圖4 血清TLR4水平與各肺炎評分的相關性

3 討論

KP是與人類關系密切的一種機會性致病菌[12]，在免疫功能低下的人群中通過鐵攝取系統、CPS、LPS等多種毒力因子，可以引起以呼吸道為主的多部位的感染。目前，治療KP感染的常用藥物有碳青霉烯類(例如亞胺培南，美羅培南)、內酰胺類及喹諾酮類等，但近年來KP的耐藥率逐漸升高[13]。此外，hvKP感染的發病率和病死率也存在持續上升趨勢，并且目前hvKP的明確診斷主要依靠細菌培養及基因檢測，需要較長的時間，給臨床治療也帶來了嚴峻的挑戰。hvKP可產生大量的莢膜多糖，并且擁有較強的抗吞噬作用以及抗殺菌作用，可以促進炎癥反應以及加重感染。莢膜多糖是hvKP重要的毒力因子，主要通過抗巨噬細胞吞噬作用、抵抗抗菌肽等作用從而幫助細菌免疫逃逸[4]。目前hvKP的分子標志物診斷仍存在爭議，本研究通過對收集的臨床菌株的毒力基因檢測，顯示rmpA1、rmpA2及magA基因聯合診斷hvKP的特異性及準確性較高，可作為臨床hvKP檢測的重要分子標志物。

從呼吸道快速清除入侵細菌對于有效的宿主防御機制對抗細菌性肺炎具有重要意義。除了直接的細菌吞噬和殺傷外，肺上皮細胞表面的TLR4識別病原菌后，可以趨化并刺激中性粒細胞等，激活免疫反應[14]，并促進CRP等的分泌，TLR4水平的上升并不是單獨的，與機體的炎性反應有密切的關聯。本研究證實hvKP侵染的人肺泡上皮細胞中TLR4表達水平明顯上升，提示肺上皮細胞對hvKP的感染做出反應并過表達TLR4介導免疫反應等對抗感染。

通過對KPN患者血清中TLR4水平的檢測，顯示與hvKP感染的患者TLR4水平相比，cKP感染的患者及健康體檢者有明顯的升高，提示TLR4可能在毒力基因的介導下參與了hvKP菌株感染人體的防御過程。根據對患者臨床預后的肺炎評分分級，結果顯示血清TLR4水平與PSI評分及CURB-65評分呈正相關性，TLR4水平越高的患者由評分預測的臨床預后情況越差，提示TLR4可作為衡量患者體內的病程進展程度的指標，血清TLR4水平可能作為hvKP感染的患者診斷和評估預后的潛在生物標志物。并且猜測，通過抑制TLR4可以減輕機體由于炎癥反應帶來的損傷，但需進一步實驗研究毒力基因與蛋白通路之間的聯系以及起到保護作用的機制。