扶正抑癌苗方顆粒的質量控制研究

晏 琴 李 江* 劉 煒 劉頂鼎

扶正抑癌苗方顆粒系貴州中醫藥大學知名老中醫劉自平教授的臨床經驗方研制而成的中藥制劑，具有多年臨床使用經驗；是由黃芪、南沙參、仙鶴草、法半夏、薏苡仁、白花蛇舌草、余甘子、吉祥草、冬凌草等12味中藥飲片制成的顆粒劑。該制劑有益氣養陰、解毒散結的功效，適用于氣陰兩虛型肺癌患者。該制劑前期已由貴州中醫藥大學第二附屬醫院呼吸內科劉煒主任醫師課題組經動物實驗驗證能抗小鼠Lewis肺癌轉移及腫瘤血管生成，具有很好的抗癌作用[1]。黃芪具有益氣升陽，解毒散結之功效，適用于氣虛乏力，中氣下陷等，其主要藥效成分為多糖類化合物[2-3]。南沙參性微寒，歸肺、胃二經，具有養陰生津，化痰益氣之功效，應肺臟“喜潤惡燥”的生理特性，兩者合用共為君藥。法半夏為臣藥，具有燥濕化痰之功效，用于痰多咳喘，痰飲昡悸，風痰眩暈等[2]。余甘子清熱潤肺生津，白花蛇舌草和薏苡仁配伍以清熱解毒，化痰散結；另以吉祥草、冬凌草合用清熱解毒，理血化瘀；仙鶴草收斂止血以治其標。本研究旨在建立扶正抑癌苗方顆粒中法半夏、薏苡仁、吉祥草、冬凌草、仙鶴草的薄層色譜鑒別方法，及以鳥苷為指標的定量研究方法，為其臨床用藥安全有效提供參考價值，同時為制定扶正抑癌苗方顆粒質量標準提供參考依據。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

三用紫外線分析儀（ZF-1型，上海金鵬分析儀器有限公司）、電熱鼓風干燥箱（101-1A型，天津市泰斯特儀器有限公司）、電子分析天平（MS105DU，萬分之一）、數顯恒溫水浴鍋（DRHH-S4，上海雙捷實驗設備有限公司）、超聲波清洗器（SK5200H，上海科導超聲儀器有限公司）、島津LS-2030型高效液相色譜儀。

1.2 試藥

半夏對照藥材（中國食品藥品檢定研究院，批號：121272-201806，規格：20 mg/瓶，薄層鑒別用）、薏苡仁對照藥材（中國食品藥品檢定研究院，批號：121254-202105，規格：20 mg/瓶，薄層鑒別用）、吉祥草對照藥材（中國食品藥品檢定研究院，批號：121314-201603，規格：20 mg/瓶，薄層鑒別用）、迷迭香酸對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：111871-201706，規格：20 mg/瓶，純度：90.5%，含量測定用）、仙鶴草對照藥材（中國食品藥品檢定研究院，批號：120966-201908，規格：20 mg/瓶，薄層鑒別用）、鳥苷對照品（成都埃法生物科技有限公司，批號：AF20073152，規格：20 mg/支，純度：99.3%，含量測定用）。扶正抑癌苗方顆粒為自制，處方所需12味中藥飲片均購自貴州中醫藥大學第二附屬醫院，經薄層色譜鑒別均為正品。甲醇、乙醇、石油醚、乙酸乙酯等均為分析純；實驗用水為純化水。

2 方法及結果

2.1 扶正抑癌苗方顆粒的定性研究

2.1.1 扶正抑癌苗方顆粒的制備 按處方量稱取12味中藥飲片，加12倍量水煎煮1 h，濾過，合并濾液，濃縮，加適量可溶性淀粉制成顆粒，即得。為有效驗證本研究重復性試驗，按扶正抑癌苗方顆粒制備方法制備3個不同批次的樣品備用（批號：20210728、20210729、20210730）。

2.1.2 法半夏的薄層色譜鑒別

2.1.2.1 樣品制備 供試品溶液制備：分別取3批扶正抑癌苗方顆粒適量，研細后，稱取粉末5 g，置于錐形瓶中，量取30 ml甲醇，加入錐形瓶中，80 ℃加熱回流1 h，放冷，過濾，濾液蒸干，取乙醚15 ml完全溶解，過濾，濾液蒸干，取甲醇1 ml使溶解，即得。對照藥材溶液的制備：取半夏對照藥材2 g，置于錐形瓶中，按 “供試品溶液制備”項下制備方法，制成半夏對照藥材溶液。陰性供試品溶液的制備：按扶正抑癌苗方工藝，制備出缺法半夏的陰性制劑，同“供試品溶液制備”項下制備方法制成缺法半夏的陰性供試品溶液。

2.1.2.2 顯色條件 參照《中華人民共和國藥典》2020版四部附錄（通則0502），用毛細管吸取上述3批供試品溶液、半夏對照藥材溶液、缺法半夏陰性供試品溶液各10 μl，分別點于同一塊硅膠G薄層板上；以石油醚（60～90 ℃）－乙酸乙酯－冰醋酸（10∶7∶0.1）為展開劑，待薄層板充分飽和后，展至約8 cm，取出，晾干，噴顯色劑：10%硫酸乙醇溶液，于105 ℃加熱至斑點顯色清晰[4]。

2.1.2.3 結果 3批扶正抑癌苗方顆粒供試品色譜在薄層板上所呈現的主斑點與對照藥材相應位置上的色譜斑點顯相同的桃紅色，而且陰性對照未出現干擾。見圖1。

圖1 扶正抑癌苗方顆粒中法半夏的薄層色譜

2.1.3 薏苡仁的薄層鑒別

2.1.3.1 樣品制備 供試品溶液制備：分別取3批扶正抑癌苗方顆粒各5 g，研細，置于燒杯中，加水20 ml，攪拌使其溶解，轉移至分液漏斗中，搖勻，用乙酸乙酯（15 ml）振搖提取2 次，收集乙酸乙酯液，蒸至約2 ml，作為供試品溶液。對照藥材溶液的制備：取薏苡仁對照藥材2 g，置100 ml錐形瓶中，加乙酸乙酯20 ml，超聲30 min，放冷，濾過，濾液蒸至約2 ml，即得。陰性供試品溶液的制備：按扶正抑癌苗方工藝，制備出缺薏苡仁的陰性制劑，同“供試品溶液制備”項下制成缺薏苡仁的陰性供試品溶液。

2.1.3.2 顯色條件 照薄層色譜法《中華人民共和國藥典》2020版四部附錄（通則0502），用毛細管吸取上述3個批號的供試品溶液、對照藥材溶液、缺薏苡仁陰性供試品溶液各5 μl，分別點于同一塊硅膠G薄層板上，以石油醚（60～90 ℃）－乙酸乙酯－乙酸（10∶3∶0.1）為展開劑，充分飽和后，展至約8 cm，取出，晾干，置紫外線燈（365 nm）下檢視[5]。

2.1.3.3 結果 3批扶正抑癌苗方顆粒供試品色譜在薄層板上所呈現的熒光主斑點與對照藥材相應位置上的色譜熒光斑點顯相同的淡藍色熒光，而且陰性對照未出現干擾。見圖2。

圖2 扶正抑癌苗方顆粒中薏苡仁的薄層色譜

2.1.4 吉祥草的薄層鑒別

2.1.4.1 樣品制備 供試品溶液制備：分別取3批扶正抑癌苗方顆粒5 g，研細，置于3個錐形瓶中，加甲醇30 ml，超聲30 min，過濾，濾液蒸至約2 ml，即得。對照藥材溶液的制備：取吉祥草對照藥材2 g，加甲醇10 ml，同“供試品溶液制備”項下制備方法，制成對照藥材溶液。陰性供試品溶液的制備：按扶正抑癌苗方工藝，制備出缺吉祥草的陰性制劑，同“供試品溶液制備”項下制備方法制成缺吉祥草的陰性供試品溶液。

2.1.4.2 顯色條件 照薄層色譜法《中華人民共和國藥典》2020版四部附錄（通則0502），用毛細管吸取上述3批供試品溶液、對照藥材溶液及缺吉祥草陰性供試品溶液各5 μl，分別點于同一塊硅膠G薄層板上，以石油醚（30～60 ℃）－乙酸乙酯（8∶1）為展開劑，充分飽和后，展開至約8 cm，取出，晾干，置紫外線燈（365 nm）下檢視[6]。

2.1.4.3 結果 3批扶正抑癌苗方顆粒供試品色譜在薄層板上所呈現的熒光主斑點與對照藥材相應位置上的色譜熒光斑點顯相同的淺綠色熒光斑點，而且陰性對照未出現干擾。見圖3。

圖3 扶正抑癌苗方顆粒中吉祥草的薄層色譜

2.1.5 冬凌草的薄層鑒別

2.1.5.1 樣品制備 供試品溶液制備：分別取3批扶正抑癌苗方顆粒適量，研成細粉，各稱取5 g，置于3個錐形瓶中，加水10 ml，攪拌均勻，過D101大孔樹脂柱（內徑1 cm，高約15 cm）；先用40 ml水洗脫，棄去水液，再用40 ml甲醇洗脫，收集甲醇溶液，蒸至約2 ml，即為供試品溶液。對照品溶液的制備：精密稱定1 mg迷迭香酸對照品，加甲醇制成每1毫升含1 mg的溶液，即為對照品溶液。陰性供試品溶液的制備：按扶正抑癌苗方工藝，制備出缺冬凌草的陰性制劑，同“供試品溶液制備”項下制備方法制成缺冬凌草的陰性供試品溶液。

2.1.5.2 顯色條件 照薄層色譜法《中華人民共和國藥典》2020版四部附錄（通則0502），用毛細管吸取3批供試品溶液、迷迭香酸對照品溶液及缺冬凌草的陰性供試品溶液各5 μl，分別點于同一塊硅膠G薄層板上，以二氯甲烷－乙酸乙酯－甲酸（6∶4∶1）為展開劑，待薄層板充分飽和后，展開至約8 cm，取出，晾干，以5%三氯化鋁－乙醇溶液為顯色劑，置紫外線燈（365 nm）下檢視[7]。

2.1.5.3 結果 3批扶正抑癌苗方顆粒供試品色譜在薄層板上所呈現的熒光主斑點與對照品相應位置上的色譜熒光斑點顯相同的藍色熒光斑點，而且陰性對照未出現干擾。見圖4。

圖4 扶正抑癌苗方顆粒中冬凌草的薄層色譜

2.1.6 仙鶴草的薄層鑒別

2.1.6.1 樣品制備 供試品溶液制備：分別取3批扶正抑癌苗方顆粒適量，研成細粉，稱取5 g，加入丙酮-乙酸乙酯（4∶1）50 ml，超聲處理30 min（功率250 W，頻率33 kHz），濾過，濾液蒸至約2 ml，即為供試品溶液。對照藥材溶液的制備：取仙鶴草對照藥材2 g，同“供試品溶液制備”項下制備方法，制成對照藥材溶液。陰性供試品溶液的制備：按扶正抑癌苗方工藝，制備出缺仙鶴草的陰性制劑，同“供試品溶液制備”項下制備方法制成缺仙鶴草陰性供試品溶液。

2.1.6.2 顯色條件 照薄層色譜法《中華人民共和國藥典》2020版四部附錄（通則0502），用毛細管吸取上述3批供試品溶液、對照藥材溶液、缺仙鶴草的陰性供試品溶液各10 μl，分別點于同一塊硅膠G薄層板上，以三氯甲烷－氨水－乙酸乙酯－甲醇（8∶0.5∶2∶3）為展開劑，待薄層板充分飽和后，展開至約8 cm，取出，晾干，至紫外燈（254 nm）下檢視[8]。

2.1.6.3 結果 3批扶正抑癌苗方顆粒供試品色譜在薄層板上所呈現的熒光主斑點與對照藥材相應位置上的色譜熒光斑點顯相同的紅色熒光斑點，而且陰性對照未出現干擾。見圖5。

圖5 扶正抑癌苗方顆粒中仙鶴草的薄層色譜

2.2 扶正抑癌苗方顆粒的定量研究（法半夏中鳥苷的含量測定）

2.2.1 色譜條件 采用Inertsil ODS-3色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動相為水（A）和乙腈（B），梯度洗脫（0～10 min：99.5%A→99%A；10～15 min：99%A→98.5%A；15～30 min：98.5%A→94.5%A；30～35 min：94.5%A→90%A），平衡時間為15 min，流速1.0 ml/min，柱溫30 ℃，進樣量10 μl，檢測波長265 nm[9-11]。

2.2.2 對照品溶液的制備 取鳥苷對照品適量，精密稱定，置5 ml量瓶中，加水適量使其溶解，用水定容至刻度，搖勻，制成每毫升含0.1 mg的溶液，即得。

2.2.3 供試品溶液的制備 精密稱定扶正抑癌苗方顆粒5 g，置于100 ml具塞錐形瓶中，加純化水20 ml，稱重，超聲30 min，放冷，再稱重，用純化水補足減失的量，轉移至25 ml量瓶中，用純化水定容至刻度。

2.2.4 陰性對照品溶液制備 按處方量制備不含法半夏的扶正抑癌苗方顆粒，精密稱取扶正抑癌苗方顆粒5 g，按“2.2.3供試品溶液的制備方法”項下制備不含法半夏的陰性供試品溶液。

2.2.5 專屬性考察 按處方制備工藝制備不含法半夏的扶正抑癌苗方顆粒，按“2.2.3供試品溶液的制備”項下處理方法，制得缺法半夏的陰性供試品溶液。精密吸取陰性供試品溶液、對照品溶液、供試品溶液各10 μl，注入液相色譜儀，按“2.2.1色譜條件”項下條件進行測定，并記錄色譜圖。見圖6～8。

圖6 鳥苷對照品的高效液相色譜

2.2.6 線性關系考察試驗 精密稱取鳥苷對照品10.20 mg置25 ml容量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，配成濃度為0.399 84 mg/ml的對照品溶液。分別精密量取濃度為0.399 84 mg/ml的鳥苷對照品溶液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3 ml至10 ml容量瓶中，用水稀釋至刻度，配成濃度為0.019 992、0.039 984、0.059 976、0.079 968、0.099 960、0.119 952 mg/ml的一系列對照品溶液，分別進樣10 μl，以峰面積（Y）為縱坐標，鳥苷濃度（X）為橫坐標，得回歸方程為：Y=7E+06X-7 409.7，r= 0.999 2。見圖9。

圖9 鳥苷對照品標準曲線

2.2.7 精密度試驗 精密用毛細管吸取鳥苷對照品溶液（99.96 μg/ml）10 μl，在“2.2.1色譜條件”項下條件同時進樣6次，測得鳥苷峰面積的相對標準偏差（RSD）為0.34%。試驗結果表明儀器的精密度良好。

2.2.8 重現性試驗 取同一批號的扶正抑癌苗方顆粒，用研缽研細，精密稱取5 g，共平行稱取6份，按“2.2.3供試品溶液的制備”項下制備供試品溶液，在“2.2.1色譜條件”項下條件進行測定，精密吸取供試品10 μl，測得峰面積積分值，并計算含量，結果平均含量為0.283 1 mg/g，RSD為1.74%。結果表明本方法重現性良好。

圖7 供試品溶液的高效液相色譜

圖8 缺法半夏的陰性溶液的高效液相色譜

2.2.9 穩定性試驗 精密吸取按“供試品溶液的制備”項下方法制備的同一批供試品溶液10 μl，在0～48 h內，按“2.2.1色譜條件”項下條件進行測定，分別在0、2、4、8、12、24、48 h進樣1次，測定鳥苷峰面積，計算RSD為0.98%。結果表明扶正抑癌苗方顆粒在48 h內穩定。

2.2.10 加樣回收試驗 取已知樣品含量的用同一批號的扶正抑癌苗方顆粒，研細，精密稱取5 g，共9份，置于100 ml具塞錐形瓶中，分別加入低（0.049 98 mg/ml）、中（0.099 96 mg/ml）、高（0.149 94 mg/ml）3種不同濃度鳥苷對照品溶液，稱定重量，超聲處理（功率250 W，頻率33 kHz）30 min，冷卻，稱定重量，分別用低（0.024 99 mg/ml）、中（0.049 98 mg/ml）、高（0.099 96 mg/ml）3種不同濃度鳥苷對照品溶液補足減失的重量，轉移至25 ml容量瓶中，用低（0.049 98 mg/ml）、中（0.099 96 mg/ml）、高（0.149 94 mg/ml）3種不同濃度鳥苷對照品溶液定容至刻度。搖勻濾過，取續濾液，即得。按“2.2.1色譜條件”項下條件進樣10 μl，并按下列公式計算回收率。結果表明平均回收率為100.93%，RSD為1.60%，加樣回收良好，說明本方法準確度較高。見表1。

表1 回收率試驗(n=9)

3 討論

扶正抑癌苗方顆粒中處方飲片化學成分復雜，且缺乏有效質量控制指標，故本研究通過薄層色譜方法對法半夏、薏苡仁、吉祥草、冬凌草、仙鶴草進行了定性研究，建立了重現性好、專屬性強、且沒有陰性干擾的鑒別方法。在法半夏的定性研究中，考察了不同處理方法和展開劑，最終將供試品回流1 h，以石油醚（60～90 ℃）－乙酸乙酯－冰醋酸（10∶7∶0.1）為展開劑，能有效提高分離度。薏苡仁的鑒別中對展開劑進行過考察，結果顯示以石油醚（60～90 ℃）－乙酸乙酯－乙酸（10∶3∶0.1）為展開劑，效果更好，且需用36%乙酸，斑點顯色更明顯。吉祥草的鑒別中對薄層板進行了考察，結果顯示以硅膠G薄層板，斑點顯色清晰且分離度較好；提取方法考察了回流與超聲，結果顯示，兩種提取方法對結果影響不大，故選用超聲提取。冬凌草的鑒別中，曾以冬凌草對照藥材進行對照，但與迷迭香酸對照品相比，顯色不明顯，故冬凌草的鑒別選用迷迭香酸對照品；另考察顯色劑的濃度，結果表明以5%的三氯化鋁-乙醇溶液為顯色劑，對應的斑點顯色更清晰。在對仙鶴草的薄層色譜鑒別中，考察了不同展開劑，最終確定以氯仿－醋酸乙酯－甲醇－氨水（8∶2∶3∶0.5）為最佳展開系統。

另外實驗前期采用薄層色譜鑒別方法對方中中藥飲片均進行過研究，但由于斑點顯色不清晰，或存在陰性干擾，最終以扶正抑癌苗方顆粒為研究對象，篩選出5味中藥飲片的定性研究方法，對組方中法半夏、薏苡仁、吉祥草、冬凌草、仙鶴草進行了薄層色譜鑒別研究；其方法簡便易行，分離斑點清晰，陰性對照無干擾，重現性好，專屬性強。

定量研究中，用一測多評法測定半夏中腺苷、鳥苷、尿苷、肌苷的含量[12]；考察過不同柱溫和流動相，但最終供試品中相應參照峰無法分開，且其中鳥苷含量最高，分離效果最好，故選擇用鳥苷對照品為指標對扶正抑癌苗方顆粒進行質量控制研究。結果為建立扶正抑癌苗方顆粒的薄層色譜鑒別方法和含量測定研究方法提供了思路，基本完成了扶正抑癌苗方顆粒的質量控制研究，也為其臨床用藥安全有效提供了參考價值，為其進一步開發及臨床應用奠定了良好的藥學基礎。