高效液相色譜法測定平喘顆粒中柚皮苷的含量

馬春琳

平喘顆粒是處方藥，本制劑是蜜麻黃、杏仁、桔梗、枳殼、甘草、葶藶子、細辛、地龍、石膏等12味中藥制成的顆粒劑，其中桔梗、枳殼粉碎成細粉入藥。枳殼味苦、辛、酸，微寒。歸脾、胃經(jīng)。而善理氣寬中，行滯消脹。古今用于胸脅氣滯，脹滿疼痛，食積不化，痰飲內(nèi)停，臟器下垂。平喘顆粒中枳殼為臣藥，方中用量較大，其有效成分明確易于檢測，經(jīng)文獻及藥典檢索，高效液相色譜法（HPLC）常作為中成藥物組方中枳殼有效成分柚皮苷的質(zhì)控標準[1-8]，因此依據(jù)藥典方法對其質(zhì)控成分柚皮苷進行HPLC測定研究。

1 儀器與試藥

高效液相色譜儀（安捷倫科技有限公司，安捷倫1260）；分析天平（梅特勒-托利多國際貿(mào)易（上海）有限公司，AB104-S）；分析天平（梅特勒-托利多國際貿(mào)易（上海）有限公司，XS205DU）；純水機（密理博，Blix 10）；甲醇為色譜純，其他試劑為分析純；柚皮苷（中國食品藥品檢定研究院，110722-201312）。

2 方法與結(jié)果

2.1 流動相考察

由于本品為蜜麻黃、杏仁、桔梗、枳殼、甘草、葶藶子、細辛、地龍、石膏等12味中藥組成的復(fù)方醫(yī)院制劑，流動相考察實驗以方中臣藥枳殼的質(zhì)控成分柚皮苷為對象進行優(yōu)化。參照藥典對柚皮苷分離度、保留時間、對稱因子、理論塔板數(shù)等進行考察。

2.1.1 供試品溶液的制備 稱取本品約1 g，準確稱量，放入帶塞子的錐形瓶中，加入25 ml甲醇，蓋上塞子，稱重，超聲處理30 min，冷卻，用甲醇補充重量，搖勻，過濾，得供試品溶液。

2.1.2 對照品溶液的制備 精密稱取適量柚皮苷對照品，加甲醇配成49.22 μg/ml溶液，即得。各溶液精密吸取10 μl，分別注入液相色譜儀，在283 nm處記錄峰面積。其中序號1乙腈∶0.1%磷酸溶液=（0～20 min：18∶82；20～22 min：18～30∶82～70；22～32 min：30∶70）；序號2乙腈∶0.1%磷酸溶液=20∶80。綜上實驗結(jié)果，條件2出峰時間過短，分離度稍差，條件1的出峰時間適中，分離度較好，可滿足檢測需求，因此選擇為流動相。見表1。

表1 流動相考察實驗結(jié)果

2.2 專屬性試驗

精密吸取橙皮苷對照液、陰性對照液和重復(fù)性試驗中的供試品溶液10 μl，注入液相色譜儀測定[9]。結(jié)果表明，對照品和供試品在同一位置都有相應(yīng)的色譜峰，保留時間一致。陰性對照色譜保留時間相同的位置沒有相應(yīng)色譜峰。結(jié)果表明其他藥味對測試結(jié)果沒有干擾。

2.3 耐用性試驗

以建立的流動相為基礎(chǔ)，稍微改變測定條件，對樣品進行測定，計算其中含量。考察了變化色譜條件，包括檢測波長和色譜柱對該方法的耐用性。結(jié)果：樣品的相對標準偏差（RSD）分別為0.042和0.043，表明耐用性良好。見表2～3。

表2 不同波長考察

表3 不同色譜柱考察

2.4 重現(xiàn)性試驗

以擬定的流動相為基礎(chǔ)，在不同型號的液相色譜儀上進行樣品測定，計算含量。以含量為依據(jù)，考察不同儀器對實驗結(jié)果的影響，結(jié)果表明：RSD=3.0%，表明重現(xiàn)性良好。見表4。

2.5 線性關(guān)系的考察

精密吸取對照品儲備液溶液1、2、5、8.35、10 ml用甲醇分別稀釋至25 ml，得質(zhì)量濃度為8.25、16.49、49.22、82.2、98.44的溶液，分別取10 ml注入液相色譜儀測定，記錄峰面積[9]。以質(zhì)量濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標繪制標準曲線，回歸方程為y=9.229 1x-2.524 2，r=0.999 7。結(jié)果表明，柚皮苷溶液在0.082 5～0.984 4 mg樣品量之間具有良好的線性關(guān)系。見表5、圖1。

圖1 柚皮苷標準曲線

表5 線性關(guān)系考察

2.6 儀器精密度測試

精密吸取10 μl 2.1.2的對照品溶液，按既定的色譜條件注入液相色譜儀[9]。重復(fù)操作6次，測定柚皮苷峰面積，RSD=0.004 0。測試結(jié)果表明，該儀器的精密度良好。

2.7 樣品穩(wěn)定性測試

精密量取2.1.1項下的樣品溶液10 μl，2 h進樣一次，即0、2、4、6、8、10 h。共6次，根據(jù)色譜峰面積計算，RSD=0.43。結(jié)果表明，樣品溶液在10 h內(nèi)穩(wěn)定，可以滿足測定要求。

2.8 重復(fù)性試驗

取同批次（批號150313）平喘顆粒6份，按2.1.1項下制備的柚皮苷含量測定方法制備供試液。用液相色譜法測定峰面積并計算柚皮苷的含量。結(jié)果顯示RSD為1.17＜2%。該方法測定平喘顆粒中柚皮苷的重現(xiàn)性好。見表6。

表6 重復(fù)性試驗考察結(jié)果

2.9 加樣回收率試驗

按照2.1.1供試品溶液的制備項下同法稱取本品約1 g，準確稱量，放入帶塞子的錐形瓶中，加入25 ml甲醇，蓋上塞子，稱重，超聲處理30 min，冷卻，用甲醇補充重量，搖勻，過濾，得供試品溶液。取2.1.2項下對照品溶液（49.22 μg/ml），即得對照品溶液。依法測得柚皮苷溶液回收率（n=6），分別為94.7%、101.3%、99.1%、101.7%、98.8%、98.8%，RSD為2.5%，加樣回收率良好。測定結(jié)果見表7。

表7 回收率試驗結(jié)果

2.10 樣品測定 取6批次平喘顆粒，按2.1.1項下制備樣品溶液，既定色譜條件測定，記錄色譜圖，計算柚皮苷含量。方法學(xué)考察顯示，在藥材質(zhì)量、生產(chǎn)條件等各項因素一致情況下，樣品質(zhì)量穩(wěn)定。見表8。

表8 樣品含量測定結(jié)果(mg/g)

3 討論

平喘顆粒為本院制劑，療效確切，方中枳殼為臣藥，用量較大，其有效成分明確。查閱相關(guān)文獻和藥典記載，枳殼中有效成分為柚皮苷，HPLC測定平喘顆粒中柚皮苷的含量可作為該制劑的質(zhì)控標準[1-8]。本研究表明，以乙腈-0.1%磷酸溶液（0～20 min：18∶82；20～22 min：18～30∶82～70；22～32 min：30∶70）為流動相，流速1.0 ml/min，檢測波長283 nm，對照品及樣品中組分均能達到基線分離，柚皮苷溶液在0.082 5～0.984 4 g呈現(xiàn)出良好的線性關(guān)系，并且峰形良好：RSD=0.004 0＜2%，儀器精密度良好；供試品溶液在10 h內(nèi)呈現(xiàn)良好穩(wěn)定性，加樣回收率良好，該制劑可用HPLC來控制藥品質(zhì)量，能夠滿足測定需要。因此，本實驗建立的HPLC測定平喘顆粒中枳殼柚皮苷含量，經(jīng)方法學(xué)和實驗結(jié)果考察，達到藥物檢測要求，可用于中藥處方平喘顆粒枳殼中柚皮苷的含量測定與質(zhì)量評價，能夠控制本院制劑平喘顆粒的質(zhì)量，保障患者用藥安全。