高效液相色譜法同時測定山七降酯通脈膠囊中金絲桃苷和槲皮素的含量

何蓉蓉 吳韶輝 劉旺培 陳華龍 李慶德 彭 晶 郭艷瓊

山七降酯通脈膠囊為醫院制劑，由三七、山楂、丹參、桑寄生等8味藥材經加工制成，具有補肝腎，活血化瘀，降血脂，抗動脈粥樣硬化等功效。山楂為該制劑中的君藥，桑寄生為該制劑中的輔佐成分。金絲桃苷和槲皮素為山楂的主要成分[1]，槲皮素為桑寄生的主要成分[2]。本文研究中參考文獻[3-10]，建立了同時測定山七降酯通脈膠囊中金絲桃苷和槲皮素含量的高效液相色譜法，該方法簡便、快速、準確、重現性好，為更好地監控和評價山七降酯通脈膠囊的質量提供科學依據。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

安捷倫1260高效液相色譜儀；XS105Du電子分析天平（瑞士Mettler Toledo公司）；超純水儀（美國Millipore公司）。

1.2 試藥

對照品：金絲桃苷（批號：111527-201809，含量：94.9%）、槲皮素（批號：100081-201610，含量：99.1%）購自中國食品藥品檢定研究院。甲醇、乙腈、磷酸均為色譜純，水為超純水，其他試劑為分析純。樣品由粵北人民醫院提供。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

采用Thermo Aquasil C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；以乙腈為流動相A，0.5%磷酸水為流動相B，梯度洗脫（0～15 min：15%A～18%A；15～29 min：18%A～23%A；29～55 min：23%A～32%A）；流速：1.0 ml/min；柱溫：40 ℃；進樣量：20 μl；波長：370 nm。

2.2 溶液制備

2.2.1 混合對照品儲備液的制備 分別精密稱取金絲桃苷22.70 mg置20 ml量瓶中，槲皮素對照品107.23 mg置100 ml量瓶中，加甲醇溶解并稀釋到刻度；分別精密移取金絲桃苷對照品溶液1.0 ml、槲皮素對照品溶液2.0 ml置同一100 ml量瓶中，加入70%甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得混合對照品儲備液。

2.2.2 對照品溶液的制備 取混合對照品儲備液2.5 ml置20 ml容量瓶中，加入70%甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為對照品溶液。

2.2.3 供試品溶液的制備 取山七降酯通脈膠囊粉末，研細，精密稱取細粉（約2 g），置50 ml容量瓶中，加70%甲醇約40 ml，超聲30 min，用70%甲醇稀釋到刻度，搖勻，用0.45 μm的濾膜濾過，取濾液作為供試品溶液。

2.2.4 陰性樣品溶液的制備 取不含山楂、桑寄生的山七降酯通脈膠囊粉末，研細，精密稱取細粉（約2 g），置50 ml容量瓶中，加70%甲醇約40 ml，超聲30 min，用70%甲醇稀釋到刻度，搖勻，用0.45 μm的濾膜濾過，取濾液作為陰性樣品溶液。

2.3 方法學考察

2.3.1 專屬性考察 精密吸取供試品溶液、對照品溶液、陰性樣品溶液各20 μl注入高效液相色譜儀中，記錄色譜圖，結果表明：供試品溶液中有與金絲桃苷對照品和槲皮素對照品保留時間一致的色譜峰，陰性樣品溶液中無相應的色譜峰，本品專屬性良好。見圖1～3。

圖1 對照品溶液色譜

2.3.2 線性關系考察與定量限 精密吸取混合對照品儲備液適量，置10 ml量瓶中，加70%甲醇稀釋的系列濃度（金絲桃苷0.336 6、0.673 2、1.346 4、2.692 8、5.385 6、10.771 2 μg/ml；槲皮素0.664 2、1.328 3、2.656 6、5.313 2、10.626 5、21.253 0 μg/ml）的混合對照品溶液；精密吸取各系列濃度的混合對照品溶液20 μl進行測定，以濃度（μg/ml）為橫坐標，峰面積為縱坐標，進行線性回歸分析結果見表1，表明各成分在各自范圍內線性關系良好。

圖2 供試品溶液色譜

表1 標準曲線測定、最低定量限檢測結果

2.3.3 儀器精密度 取同一混合對照品溶液，連續進樣6次，各成分色譜峰峰面積的相對標準偏差（RSD）分別為0.9%、0.4%，表明儀器精密度良好。

2.3.4 重復性試驗 取同一批樣品（批號為20190315），研細，取6份，精密稱定（約2 g），依“2.3”項下的方法制得樣品溶液，進樣測定，結果6份樣品各成分之間的RSD分別為1.4%、1.2%（n=6），說明本方法的重現性良好。

2.3.5 穩定性試驗 取同一份樣品溶液（批號為20190315），分別在0、6、12、24 h進樣測定，各成分色譜峰峰面積的RSD分別為2.7%、1.2%，結果表明樣品在24 h內穩定。

2.3.6 回收率試驗 取同一批樣品（批號為20190315），研細，取9份，精密稱定（約1 g），精密加入混合對照品溶液適量，依“2.2.3”項下的方法制得供試品溶液，進樣測定，計算回收率，結果表明本方法的回收率較好。見表2。

表2 山七降酯通脈膠囊加樣回收率試驗結果

2.3.7 樣品含量的測定 分別取不同批次的樣品，按照2.2.3實驗方法進行操作，按2.1實驗條件進行測定，代入線性回歸方程，計算金絲桃苷、槲皮素的含量。見表3。

表3 不同批號樣品測定結果(μg/g)

圖3 陰性樣品溶液色譜

3 討論

3.1 提取條件的選擇

對提取溶劑（甲醇、乙醇、70%甲醇、70%乙醇）進行比較，結果70%甲醇提取率高，提取的成分多，且各成分在色譜系統中分離度較好。

3.2 液相條件的選擇

3.2.1 流動相的選擇 實驗比較了乙腈-0.5%磷酸水、乙腈-0.5%醋酸水、乙腈-0.05 moL/L磷酸二氫鉀（磷酸調pH至3.0）水溶液、乙腈-0.05 moL/L醋酸銨水溶液等多種流動相，發現選擇乙腈-0.5%磷酸水為流動相，實驗條件簡單，各色譜峰能達到良好的分離，也可更好地保護液相色譜儀。

3.2.2 波長的選擇 實驗比較了210 nm、254 nm、360 nm、370 nm波長，發現選擇370 nm條件下，基線無干擾，色譜峰的峰形、分離度及出峰數量等方面較好。

3.2.3 色譜柱的選擇 實驗比較了Thermo Aquasil C18色譜柱、Phenomenex luna C18色譜柱、JADE-PAK KM-C18色譜柱，發現使用各種色譜柱，該色譜條件下化合物均能達到良好的分離。

3.3 樣品分析

樣品測定結果表明3批樣品中金絲桃苷和槲皮素的含量差異不大，說明各批次產品的差異性不大。

綜上所述，建立山七降脂通脈膠囊HPLC色譜條件，分別測定制劑中山楂、桑寄生的有效成分金絲桃苷、槲皮素的含量。結合原制劑標準中山楂、丹參、澤瀉、桑寄生的薄層鑒別建立質量控制標準操作規程，保證山七降脂通脈膠囊質量的穩定性、有效性和可控性。