不同產地齒瓣石豆蘭簡單序列重復區間擴增遺傳多樣性研究

黃麗蕓 陳小兵

齒瓣石豆蘭為蘭科石豆蘭屬植物，分布在江西、廣西、福建、廣東、浙江等地，文獻[1-4]記載具有滋陰降火、清熱消腫之功效，可用于急性咽炎、扁桃體炎等，野生品種較少，具有較高的藥用價值。本研究以簡單重復序列間擴增（ISSR）分子標記技術從遺傳多樣性方面對其分析研究，探究不同產地齒瓣石豆蘭遺傳多樣性及親緣關系，為各地齒瓣石豆蘭的資源開發提供基礎研究數據。

1 材料與方法

1.1 試藥

采集江西省贛州市、江西省遂川縣、廣東省羅浮山等地的野生齒瓣石豆蘭，經江西中醫藥大學國家二級技師顏干明鑒定為齒瓣石豆蘭。見表1。

表1 采集信息

1.2 試劑與儀器

試劑：Taq Plus DNA 聚合酶（翌圣生物科技（上海）股份有限公司，批號：10101ES80）、DNA 提取試劑盒（天根生化科技（北京）有限公司，批號：DP321-03）、滅菌用水等。

儀器：PCR反應擴增儀（BBI，型號：PCR-96）、凝膠電泳儀（北京六一生物科技有限公司，型號：DYCP-31E）、凝膠成像系統（上海復日科技有限公司，型號：FR980）、潔凈工作臺（江蘇蘇州凈化設備廠，型號：SW-CJ-1D）、冷凍高速離心機（安徽嘉文儀器裝備有限公司，型號：JW-2018H）等。

1.3 方法

1.3.1 DNA的提取與檢測 取采摘的齒瓣石豆蘭樣品，用試劑盒提取出其基因DNA。將所得的DNA溶液裝入滅菌離心管，用凝膠電泳檢測成像，記錄結果。

1.3.2 PCR的引物篩選、擴增與檢測 參考蘭科植物研究文獻[5-7]中出現的引物，以及哥倫比亞大學（UBC）公布的100條引物序列，隨機選取3個齒瓣石豆蘭模板DNA，從中篩選出10條反應體系穩定、擴增條帶較清晰、多態性比例較好的引物，最優引物序列見表2。實驗優化后，最終確定本實驗的ISSR-PCR 反應體系為：DNA樣品1 μl，引物1 μl，2×Es Taq MasterMix（Dye）10 μl，最后滅菌水加至20 μl。擴增反應程序為：95 ℃預變性5 min，94 ℃變性30 s，54 ℃退火30 s，72 ℃總延伸1 min，共35個循環；4 ℃保存。最后在2%瓊脂糖凝膠、150 V電壓下電泳30 min，置于凝膠成像系統上分析成像[8-10]，拍照保存。

表2 最優引物序列

1.3.3 數據處理與分析 根據樣品擴增譜帶信息，對于不同產地的齒瓣石豆蘭DNA樣品在瓊脂糖凝膠電泳統計時按照有條帶為1，無條帶為0的原則，用Quantity One軟件對圖譜上的條帶進行標記，導出為0-1矩陣數據[11-13]，通過Popgene v1.32軟件進行遺傳學分析，得出其遺傳特征系數[14-17]，對不同產地齒瓣石豆蘭進行遺傳一致度與遺傳距離分析[18-19]。

2 結果

2.1 ISSR-PCR擴增結果

用篩選出的10個引物對29個齒瓣石豆蘭樣品進行ISSR-PCR擴增，共擴增出243條清晰的條帶，其中多態性條帶223條，有效條帶數占總條帶數91.77%。優選10條引物擴增出的有效條帶數范圍為8～16條。引物UBC806擴增出的條帶最多，為30條；引物UBC819擴增條帶最少，為13條。

2.2 齒瓣石豆蘭遺傳多樣性分析

由多態性位點可知，齒瓣石豆蘭的遺傳變異情況由低到高為FS＜YY＜SC＜LFS＜JLS，變化范圍是20.50%～40.18%；由等位基因數（Na）可知，齒瓣石豆蘭的遺傳變異情況由低到高為FS＜YY＜SC＜LFS＜JLS，變化范圍是1.365 6～1.437 4；由有效等位基因數（Ne）可知，齒瓣石豆蘭的變異情況由低到高依次為FS＜YY＜SC＜JLS＜LFS，變化范圍是1.211 8～1.329 0；由Nei’s基因多樣性指數（h）得出，齒瓣石豆蘭變異情況由低到高依次是FS＜YY＜SC＜JLS＜LFS，變化范圍是0.089 8～0.201 3；依據Shannon’s信息指數（I），齒瓣石豆蘭的變異情況由低到高依次是FS＜YY＜SC＜JLS＜LFS，變化范圍是0.149 8～0.259 3。見表3。

表3 遺傳多樣性分析

2.3 遺傳距離與遺傳一致度

不同產地齒瓣石豆蘭之間遺傳一致度為0.789 2～0.908 9，遺傳距離為0.098 5～0.240 1。見表4。

表4 遺傳一致度和遺傳距離

2.4 聚類分析

按照地理緯度，本次采集的緯度差異相對較小，聚類分析結果見圖1，遺傳一致度為0.79～0.90，由聚類分析可知，贛州峰山、贛縣楊雅村、龍南九連山、遂川縣的親緣關系較近。

圖1 齒瓣石豆蘭種群間的聚類分析

3 討論

本研究利用ISSR方法對江西中南部地區及廣東羅浮山地區齒瓣石豆蘭進行遺傳多樣性分析，以其遺傳距離進行親緣關系分析，發現不同產地齒瓣石豆蘭之間遺傳一致度為0.789 2～0.908 9，遺傳距離為0.098 5～0.240 1，表明此地區內齒瓣石豆蘭遺傳多樣性小，親緣關系較近。

齒瓣石豆蘭的遺傳多樣性與生長的地理位置距離具有一定的關聯，本次摘取的齒瓣石豆蘭生長地域位置相差不大，其間的遺傳多樣性較小，所屬親緣關系較近，植物資源的遺傳多樣性越豐富越有利于新品種選育，資源的親緣關系越近越有利于植物間育種。本研究首次以分子標記技術為蘭科植物齒瓣石豆蘭進行遺傳多樣性分析，對其后期的規范種植及資源開發等提供了科學依據。