基于網絡藥理學聯合GEO數據庫及分子對接技術探討化瘀丸治療乳腺癌的作用機制

劉敏，李羿南，張青*

·信息技術與中醫藥·

基于網絡藥理學聯合GEO數據庫及分子對接技術探討化瘀丸治療乳腺癌的作用機制

劉敏1，李羿南2，張青1*

1.首都醫科大學附屬北京中醫醫院，北京 100010；2.北京中醫藥大學，北京 100029

通過網絡藥理學聯合GEO數據庫差異基因分析及分子對接技術研究化瘀丸治療乳腺癌的有效成分及作用機制。利用TCMSP數據庫檢索化瘀丸中12味中藥信息，獲得化瘀丸的活性成分和分子靶點。通過GEO數據庫檢索“breast cancer”篩選后獲得GSE139038數據，通過R軟件分析得出差異基因。通過DrugBank、OMIM、TTD和CTD數據庫篩選出乳腺癌的相關靶點，利用UniProt數據庫對靶點進行基因注釋，通過Cytoscape3.2.1軟件構建化瘀丸與乳腺癌的成分-靶點網絡圖，使用插件BisoGenet和CytoNCA繪制核心靶點拓撲網絡，并進行藥物與疾病交集靶點的GO功能與KEGG通路富集分析，最后將網絡中度值較高的成分與核心靶點進行分子對接。從GEO數據庫下載分析得到乳腺癌上調和下調最明顯的差異基因40個。獲得化瘀丸主要活性成分7個，包括山柰酚（kaempferol）、谷甾醇（sitosterol）、異鼠李素（isorhamnetin）、常春藤皂苷元（hederagenin）、槲皮素（quercetin）、β-谷甾醇（beta-sitosterol）和豆甾醇（stigmasterol）等，作用于JUN、FOS、MYC、E2F1、E2F2等32個基因靶點。GO功能與KEGG通路富集分析表明，化瘀丸治療乳腺癌主要通過調節氧化應激、激活轉錄因子結合、趨化因子受體結合等生物反應，作用于病毒感染通路、細胞衰老信號通路、IL-17信號通路、肝癌通路等發揮治療作用。化瘀丸治療乳腺癌的活性成分為槲皮素等，主要涉及病毒感染、IL-17及其他與癌癥相關的通路。

化瘀丸；乳腺癌；網絡藥理學；生物信息學；分子對接；作用機制

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，據國際癌癥研究中心GLOBOCAN對全球185個國家/地區的36種癌癥的發病率、死亡率及癌癥發展趨勢的統計數據，2020年新發乳腺癌2 261 419例，占總體癌癥發病的11.7%[1]。目前，西醫治療乳腺癌的主要方法是手術、化療、靶向治療、免疫治療、放射治療等，中醫藥治療乳腺癌效果顯著且不良反應較小。采用中醫藥防治乳腺癌成為研究熱點。國家級名老中醫郁仁存教授以益氣活血、化瘀解毒立法，創立化瘀丸，臨床用于治療乳腺癌等腫瘤效果顯著[2]。本研究通過網絡藥理學聯合基因芯片數據庫GEO（Gene Expression Omnibus），獲取正常乳腺與乳腺癌標本的基因芯片，分析兩者存在的差異表達基因，為乳腺癌腫瘤標記物的進一步研究提供參考，并通過分子對接技術評價受體和藥物分子親和關系。將網絡藥理學、GEO數據庫和分子對接技術相結合，對化瘀丸的主要活性成分進行篩選，分析活性成分的作用靶點和生物通路，深入探索化瘀丸治療乳腺癌的分子機制，為乳腺癌患者的精準治療提供依據。

1 資料與方法

1.1 化瘀丸活性成分收集與篩選

化瘀丸由砂仁、桃仁、赤芍、黃芪、拳參、白芷、莪術、郁金、王不留行、延胡索、紅參、西紅花12味組成。通過TCMSP（https://tcmsp-e.com/）檢索化瘀丸的活性成分，獲取分子信息，包括活性成分的分子名稱、口服生物利用度（OB）、類藥性（DL）等。以OB≥30%和DL≥0.18[3]為篩選條件，得到活性成分。

1.2 化瘀丸作用靶點與乳腺癌靶點預測

通過TCMSP獲得活性成分對應靶點信息，利用UniProt數據庫（http://www.uniprot.org/）進行校正，獲得對應的基因名稱。將靶點基因的全稱轉化為簡稱，并刪除無對應基因的靶點。利用DrugBank數據庫（https://www.drugbank.ca）、OMIM數據庫（https://www.omim.org/）、CTD數據庫（http://ctdbase.org/）和TTD數據庫（http://bidd.nus.edu.sg/BIDD-Databases/TTD/TTD.asp），以“breast cancer”為關鍵詞檢索，得到疾病相關的基因及靶點信息。將藥物靶點與疾病靶點取交集，獲得化瘀丸與乳腺癌的交集靶點，即化瘀丸治療乳腺癌的潛在作用靶點。

1.3 乳腺癌GEO芯片差異分析

在GEO數據庫（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）檢索“breast cancer”，篩選并下載GSE139038芯片，使用R軟件設定差異倍數（fold change，FC）絕對值＞1且校正后值（adjPvalue）＜0.05作為顯著差異基因的篩選條件，得出差異分析結果，并繪制熱圖：使用R語言中的packages、pheatmap、Limma程序包對數據進行二次分析，結合值和FC值進行篩選，選取上調、下調最明顯的前20個基因，并定義分組（C為正常對照組，T為乳腺癌組）顏色、高度，繪制熱圖。火山圖繪制：設置軸與軸最大值，將基因統一設置為無差異基因，用黑色表示，再通過、logFC進行篩選。當＜0.05且logFC＞1，表示該基因上調，用紅色表示；＜0.05且logFC＜-1，表示該基因下調，用綠色表示。

1.4 中藥-活性成分-靶點-疾病網絡構建

將化瘀丸治療乳腺癌的潛在作用靶點即交集基因輸入Cytoscape3.2.1軟件，構建中藥-活性成分-靶點-疾病網絡。用節點（node）表示分子、靶蛋白，用邊（edge）表示活性成分與靶點之間的關系。采用Network Analyzer插件進行網絡特征分析，以明確化瘀丸中重要的活性成分及靶點。

1.5 蛋白互作網絡構建與分析

利用Cytoscape3.2.1軟件的BisoGenet和CytoNCA插件對蛋白互作（PPI）網絡節點進行分析，設置度中心性（DC）＞61、介度中心性（BC）＞600[4]，篩選重要基因。獲得的相關活性成分可能直接或間接調控這些靶點發揮重要作用。

1.6 GO功能富集分析

使用R軟件對化瘀丸治療乳腺癌的基因進行GO富集分析。根據富集的數目和顯著程度（＜0.05，＜0.05），選取前20條富集條目，分別進行生物過程（biological process，BP）、細胞成分（cellular component，CC）、分子功能（molecular function，MF）的富集，繪制柱狀圖。

1.7 KEGG富集分析

使用R軟件對化瘀丸治療乳腺癌的基因進行KEGG富集分析，使用DOSE、clusterProfiler、enrichplot、colorspace、stringi、ggplot2程序包進行分析。根據基因富集的數目和顯著程度（＜0.05，＜0.05），取前20條KEGG通路，將得到的KEGG通路導入Cytoscape3.2.1軟件，根據degree值大小，繪制通路與基因網絡圖。

1.8 分子對接

從RSCB PDB數據庫（https://www.rcsb.org/）下載核心靶點及PPI網絡中核心蛋白的3D結構PDB格式文件，在PubChem中下載配體，對接軟件為AutoDock Tools1.5.6，選擇默認設置，設置Grid Box為整個蛋白分子，運行Local Search Parameters進行分子對接，對接成功后，選擇分數最高的配體-受體構象繪制對接示意圖。

2 結果

2.1 化瘀丸活性成分

通過TCMSP數據庫，以OB≥30%、DL≥0.18為條件篩選，獲得化瘀丸共計136個化合物，其中砂仁9個，桃仁19個，黃芪17個，拳參6個，白芷20個，莪術1個，郁金3個，王不留行4個，延胡索49個，紅參3個，西紅花5個。

2.2 化瘀丸作用靶點與乳腺癌疾病靶點信息

將TCMSP數據庫預測的化瘀丸成分靶點通過UniProt數據庫進行基因注釋后得到注釋基因，通過DrugBank、OMIM、CTD、TTD數據庫檢索后得到相關基因，取交集，共獲得40個交集靶點，分別是PTGS2、DPP4、ADRB2、JUN、NR3C2、ADH1C、PPARG、MMP9、TOP2A、E2F2、IGHG1、OLR1、CAV1、ABCG2、IGF2、ADRA2A、MMP1、MYC、CXCL11、GSTA1、MAOA、STAT1、F3、CXCL2、GSTA2、CHEK1、GSTM2、CCNB1、CXCL10、CAT、CCNA2、AKR1C3、THBD、SPP1、GSR、ADH1B、FOS、SERPINE1、E2F1、AKR1C1。

2.3 乳腺癌GEO芯片差異分析

GEO數據庫下載GSE139038芯片數據，獲取相關的正常乳腺組織和乳腺癌標本的芯片，分析二者存在的差異表達基因。樣本中正常對照組24個樣本，乳腺癌組41個樣本。利用R軟件和相關的軟件包對GSE139038進行過濾機標準化，篩選差異基因。共得到乳腺癌上調和下調最明顯的差異基因40個，其中上調10個，下調30個。正常對照組與乳腺癌組差異基因火山圖及基因熱圖見本文OSID碼。

2.4 化瘀丸治療乳腺癌的活性成分及靶點網絡

將化瘀丸與乳腺癌差異基因取交集后，導入Cytoscape3.2.1軟件，根據不同靶點與有效成分對應關系和數目進行分類展示。得到潛在基因靶點40個，對應有效成分100個。其中山柰酚（kaempferol）、谷甾醇（sitosterol）、異鼠李素（isorhamnetin）、常春藤皂苷元（hederagenin）、槲皮素（quercetin）、β-谷甾醇（beta-sitosterol）和豆甾醇（stigmasterol）為共有有效成分。在7個共有有效成分中，槲皮素對應靶點最多，因此槲皮素可能是化瘀丸治療乳腺癌的關鍵活性成分，見圖1。

2.5 化瘀丸治療乳腺癌基因的蛋白互作網絡

將化瘀丸與乳腺癌差異基因取交集后，通過Cytoscape3.2.1軟件繪制PPI網絡圖，藍色代表化瘀丸與乳腺癌差異基因取交集后的所有靶點，黃色代表核心基因，紅色代表目標基因（見本文OSID碼）。借助BisoGenet和CytoNCA插件，分別設置度中心性（DC）＞61、介度中心性（BC）＞600，構建拓撲網絡，篩選出目標基因MYC，見圖2。

注：黃色為靶點基因，紅色為化瘀丸共同有效成分，藍色為元胡有效成分，綠色為白芷有效成分，深藍為王不留行有效成分，紫色為砂仁有效成分，玫紅為拳參有效成分，橘黃為桃仁有效成分，淡黃為黃芪有效成分，淡藍為郁金有效成分，深綠為紅參有效成分

圖2 化瘀丸治療乳腺癌基因拓撲網絡（DC＞61，BC＞600）

2.6 GO功能富集分析

利用R軟件，將化瘀丸治療乳腺癌的基因進行GO富集分析。根據富集顯著程度，繪制BP（前20條）、CC（3條）、MF（前20條）柱狀圖。BP主要涉及機械刺激反應、對含嘌呤化合物的反應、抗氧化反應、成纖維細胞增殖的調節、脂肪酸反應等（見圖3）；CC主要涉及RNA聚合酶Ⅱ轉錄因子復合物、核轉錄因子復合體和轉錄因子復合物（見圖4）；MF主要涉及抗氧化活性、過氧化物酶的活性、氧化還原酶活性（以過氧化物為受體）、趨化因子受體結合、谷胱甘肽轉移酶活性、激活轉錄因子結合等（見圖5）。

圖3 化瘀丸治療乳腺癌靶點GO富集分析BP條目（前20條）

圖4 化瘀丸治療乳腺癌靶點GO富集分析CC條目

2.7 KEGG通路富集分析及基因通路網絡圖

利用R軟件對化瘀丸治療乳腺癌的基因進行富集分析，共富集到42條通路。將KEGG通路導入Cytoscape3.2.1軟件，取前20條通路。根據Degree值對通路的富集程度，繪制通路基因網絡圖（見 圖6）。其中富集靶點較多的通路有：液體剪切應力和動脈粥樣硬化通路（Fluid shear stress and atherosclerosis）、乙肝通路（Hepatitis B）和卡波西肉瘤相關的皰疹病毒感染通路（Kaposi sarcoma-associated herpesvirus infection）均富集8個靶點，IL-17信號通路（IL-17 signaling pathway）、細胞衰老信號通路（Cellular senescence）、肝癌通路（Hepatocellular carcinoma）、愛潑斯坦-巴爾病毒感染（Epstein-Barr virus infection）、人T細胞白血病病毒1型感染（Human T-cell leukemia virus 1 infection）通路均富集7個靶點。KEGG通路對應的前5位靶點基因分別是JUN、FOS、E2F1、E2F2、MYC。

圖5 化瘀丸治療乳腺癌靶點GO富集分析MF條目（前20條）

圖6 化瘀丸治療乳腺癌KEGG通路與基因網絡

2.8 化瘀丸藥效成分槲皮素與5種蛋白的分子對接

將化瘀丸活性成分槲皮素與圖6中富集前5位的核心靶點蛋白使用AutoDock軟件進行分子對接，對接結果見圖7。分子與靶點蛋白的最低結合能均為0，說明配體和受體均可以自發結合。

圖7 化瘀丸有效成分槲皮素與核心靶點分子對接模式圖

3 討論

乳腺癌是中國女性最常見的惡性腫瘤，發病率位居中國女性惡性腫瘤首位，發病年齡日趨年輕化[5]。國家級名老中醫郁仁存教授認為痰、毒、瘀作為病理產物貫穿乳腺癌發生和發展的整個過程，針對痰瘀毒結的主要病因病機而確立的化痰、祛瘀、解毒治法貫穿乳腺癌治療的始終，創立化瘀丸常加減應用于乳腺癌的辨證用藥，收效甚佳。基礎研究結果顯示，化瘀丸含藥血清可提高Lewis細胞內阿霉素藥物濃度，具有化療增效作用[6]。本文從網絡藥理學研究出發，從分子機制角度，闡述化瘀丸治療乳腺癌的作用機制，為進一步研究提供理論依據。

通過網絡藥理學的預測及分析，選擇出核心成分，為臨床化瘀丸配伍關系提供參考依據。通過預測，槲皮素可能為化瘀丸治療乳腺癌的有效成分。現代藥理研究表明，槲皮素在體內外能夠有效抑制多種腫瘤細胞的生長、遷移和轉移，以及血管生成，并誘導腫瘤細胞發生凋亡、壞死，用于治療肝癌、胃癌、結腸癌、乳腺癌等[7-8]。同時，槲皮素對放化療具有增敏和緩解不良反應的功效[9]。由此可見，槲皮素具有良好的抗癌功效，并且可能成為抗癌增敏劑，從而應用于臨床。

本研究篩選化瘀丸的100個活性成分，其中具有潛在治療乳腺癌作用的有7個有效成分，槲皮素位于活性成分的核心位置，有關槲皮素作用于乳腺癌的相關機制分析文獻證實了本研究的結果[10-12]。此外，山柰酚、β-谷甾醇也可以在體外抑制乳腺癌細胞的增殖，誘導乳腺癌細胞凋亡[13-14]。異鼠李素不僅可以同自噬/有絲分裂抑制劑結合后用于治療三陰性乳腺癌，而且還能抑制細胞生長、產生細胞毒性、增加氧化應激、阻滯細胞周期等[15]。因此，本研究認為化瘀丸可以通過多種途徑和方式治療乳腺癌。

通過拓撲網絡的構建，篩選出排名前5位的候選基因是JUN、FOS、E2F1、E2F2和MYC。原癌基因c-fos作為FOS的同系物，是最早發現的即早基因之一。它和JUN家族基因以同源或異源二聚體的形式結合在一起，調控細胞的生命活動，其中c-fos和c-Jun組成的異源二聚體是最穩定的形式，并在腫瘤發生、轉化、血管生成、侵襲和轉移中具有重要作用[16]。E2F轉錄因子家族在細胞的增殖分化及凋亡中起著非常重要的調節作用。其中E2F1是E2F家族重要的轉錄因子，在細胞周期的調節和凋亡中發揮重要作用。有相關文獻報道，E2F1在正常組織中的表達明顯低于癌組織，在癌組織中的表達與腫瘤分級、淋巴結轉移及腫瘤TNM分期有關，可見E2F1在乳腺癌中的表達與乳腺癌的發生發展密切相關[17]。E2F2蛋白也在乳腺癌組織中高表達，其表達水平與乳腺癌的發生、發展及生存預后密切相關，可以為乳腺癌分子診斷與靶向治療提供參考[18]。MYC癌基因作為近年來分子生物學的研究熱點之一，已被證實在人類許多腫瘤的惡性進展中起重要作用。MYC在乳腺癌組織中的高表達與腫瘤直徑、細胞學分級、病理分期、激素受體狀態、HER2狀態有關；且MYC陽性患者5年內復發轉移風險增高，MYC陽性表達與乳腺癌預后相關[19]。

GO富集分析結果顯示，化瘀丸的功效與氧化應激、轉錄因子的激活、趨化因子受體結合等有關。轉錄因子涉及多種多樣，有研究表明，Krüppel樣轉錄因子8（KLF8）在乳腺癌組織及乳腺癌細胞中均呈高表達，且與乳腺癌患者的雌激素受體（ER）和孕激素受體（PR）狀態及預后生存有關，可能作為促癌基因參與了乳腺癌的進展，或可為乳腺癌預后判斷及分子靶向治療提供新的切入點[20]。高遷移率族（high-mobility group，HMG）盒轉錄因子1（HMG-box transcription factor 1，HBP1）基因的表達影響乳腺癌的發生發展，并與乳腺癌預后呈正相關[21]。信號轉導和轉錄激活因子6（signal transducers and activators of transcription 6，STAT6）的陽性表達在不同分子分型乳腺癌中無差異，與組織學分級、臨床分期及腋窩淋巴結轉移相關；細胞程序性死亡-配體1（PD-L1）的陽性表達在三陰型乳腺癌中較高，與組織學分級和臨床分期相關；非特殊型浸潤性乳腺癌細胞STAT6與PD-L1表達呈正相關[22]。信號轉導和轉錄激活因子3（signal transducers and activators of transcription 3，STAT3）是STAT家族成員之一，在細胞轉化、凋亡、分化和生長調控中具有關鍵作用[23]。在一組14種乳腺癌細胞系中，僅在三陰性乳腺癌（TNBC）細胞中發現了組成性激活的STAT3。由此可見，STAT3可能是治療TNBC的一個重要靶點[24]。趨化因子及受體對腫瘤細胞有調控作用，主要包括調控腫瘤細胞生長、腫瘤細胞代謝、腫瘤細胞干性、腫瘤細胞凋亡、腫瘤細胞侵襲等。同時趨化因子及其受體對腫瘤相關免疫細胞有調節作用，包括巨噬細胞、T淋巴細胞、骨髓來源的免疫抑制細胞及樹突狀細胞等[25]。

KEGG富集通路結果顯示，化瘀丸治療乳腺癌主要涉及病毒感染相關通路、IL-17信號通路、細胞衰老信號通路及其他與癌癥相關的信號通路。多項研究證實病毒與癌癥的發生發展關系密切，乳腺作為性激素作用的靶器官，人乳頭瘤病毒（HPV）在乳腺癌的發生發展中的作用也備受關注[26]。一項Meta分析顯示，HPV陽性人群乳腺癌的發病率明顯高于正常人群[27]。IL-17在腫瘤中的臨床意義存在很大爭議，不同研究表明，IL-17在腫瘤發生發展中不僅與腫瘤類型有關，在一定程度上與腫瘤微環境相關。IL-17可能通過參與三陰性乳腺癌腫瘤間質中炎癥反應和微血管形成，從而促進腫瘤的生長、侵襲及遠處轉移等惡性生物學行為的發生，導致乳腺癌不良的預后[28]。細胞衰老在乳腺癌的發生發展過程中起重要作用，包括復制性細胞衰老、癌基因誘導細胞衰老、治療誘導的細胞衰老。腫瘤細胞衰老相關分泌表型具有雙面性，既可抑制腫瘤又可促進腫瘤進展。腫瘤細胞衰老相關分泌表型也有雙向調節作用，在癌變早期主要發揮正向調節作用，而在腫瘤晚期主要發揮負向調節作用。不同類型的乳腺癌產生不同程度的衰老相關分泌表型，重塑腫瘤微環境，促進乳腺癌進展[29]。槲皮素可以通過抗骨相關細胞衰老作用治療雌激素缺乏骨質疏松癥[30]。槲皮素可以下調IL-6/STAT3信號通路的活性，減少炎性因子水平，阻礙腫瘤細胞的增殖，促進腫瘤細胞的凋亡，從而保護結腸炎性相關結腸癌小鼠組織損傷[31]。

本研究通過網絡藥理學探討了化瘀丸治療乳腺癌靶點的網絡關系，顯示化瘀丸的有效成分與疾病靶點之間的作用機制，提示化瘀丸治療乳腺癌具有多靶點、多途徑、多通路的特點，為進一步實驗研究提供指導。本研究也存在一定的局限性，如有效成分相關靶點尋找和確認方法需要進一步優化，化瘀丸與IL-17、細胞衰老、癌癥相關等信號通路的關系需要實驗性證據，本課題組將在后續的研究中進一步進行實驗驗證。

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Discussion on the Mechanism and ofPills in the Treatment of Breast Cancer Based on Network Pharmacology Combined with GEO Database and Molecular Docking Technology

LIU Min1, LI Yi-nan2, ZHANG Qing1*

(1. Beijing Hospital of Traditional Chinese Medicine, Capital Medical University, Beijing 100010, China; 2. Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 100029, China)

To study the effective components and action mechanism ofPills in the treatment of breast cancer through the combination of GEO database differential gene analysis and molecular docking technology.The TCMSP database was used to retrieve the information of 12 types of Chinese materia medica inPills, and the active components and molecular targets ofPills were obtained.GSE139038 chip data were obtained from the GEO database through searching breast cancer, and the difference genes were analyzed through R software. Targets for the treatment of breast cancer were screened through DrugBank, OMIM, TTD and CTDdatabases.Gene annotation was performed on the target using the UniProt database. The composition-target network map ofPills and breast cancer was constructed by Cytoscape3.2.1 software, and the core target topological network was plotted using plug-ins BisoGenet and CytoNCA. GO enrichment analysis and KEGG enrichment analysis were performed for drugs and disease genes. Finally, the components with high degree of the network were under molecular docking with the core target.From the GEO database, 40 genes with the most significant difference of up-regulated and down-regulated breast cancer were obtained. 7 effective active components ofPills were obtained, including kaempferol, sitosterol, isorhamnetin, hederagenin, quercetin, beta-sitosterol, stigmasterol, which acted on 32 gene targets including JUN, FOS, MYC, E2F1, E2F2, etc. GO function and KEGG pathway enrichment analysis showed that oxidative stress, activation of the transcription factor, chemokinine receptor binding and other aspects were mainly involved in the treatment of breast cancer byPills. The pathways involved in virus infection, cellular senescence signaling pathway, IL-17 signaling pathway, and pathways in hepatocellular carcinoma.The important active components ofPills in the treatment of breast cancer are quercetin, etc., and virus infection, IL-17 and other signaling pathways of cancers are involved.

Pills; breast cancer; network pharmacology; bioinformatics; molecular docking; mechanism

R285；R273.79

A

2095-5707(2022)05-0001-08

10.3969/j.issn.2095-5707.2022.05.001

劉敏,李羿南,張青.基于網絡藥理學聯合GEO數據庫及分子對接技術探討化瘀丸治療乳腺癌的作用機制[J].中國中醫藥圖書情報雜志,2022,46(5):1-8.

恩施州科技計劃研究與開發項目（JCY2019000040）

劉敏，E-mail: liumin624@ccmu.edu.cn

張青，E-mail: zhangqingys@sina.com

（2021-11-24）

（修回日期：2022-01-14；編輯：魏民）