基于網絡藥理學探討真人養臟湯治療潰瘍性結腸炎的作用機制

陽凌峰，張彧，徐寅，林瑞芳，喻斌*

基于網絡藥理學探討真人養臟湯治療潰瘍性結腸炎的作用機制

陽凌峰1，張彧1，徐寅2，林瑞芳1，喻斌2*

1.湖南中醫藥大學，湖南 長沙 410208；2.湖南中醫藥大學第一附屬醫院，湖南 長沙 410007

應用網絡藥理學方法探討真人養臟湯治療潰瘍性結腸炎的作用機制。利用TCMSP數據庫及相關文獻篩選真人養臟湯的活性成分及對應靶點，通過GEO、DisGeNET、GeneCards、PharmGKB、DrugBank數據庫獲取與潰瘍性結腸炎相關的靶點，并獲取藥物與疾病的交集靶點，通過STRING數據庫和R語言對交集靶點進行蛋白相互作用分析和富集分析，借助Cytoscape3.7.2軟件篩選關鍵靶點和關鍵成分，然后通過AutoDock軟件進行分子對接驗證。共篩選出活性成分82個，包括山柰酚、人參皂苷rh2、柯里拉京、甘草查爾酮A、鞣花酸、芒柄花黃素、人參皂苷rf、油酸、玫瑰樹堿、肉桂醛等，其作用主要涉及IL6、TNF、IL1B、CASP3、HMOX1、CASP8、CASP1等74個靶點，靶點主要與NF-кB、C型凝集素受體、Toll樣受體、NOD樣受體、EB病毒感染、人類巨細胞病毒感染、細胞凋亡等信號通路有關；分子對接結果顯示關鍵成分與對應的關鍵靶點具有較強的結合活性。真人養臟湯可能通過參與炎癥、感染、細胞凋亡等相關信號通路及生物功能發揮治療潰瘍性結腸炎的作用。

網絡藥理學；GEO數據庫；分子對接；真人養臟湯；潰瘍性結腸炎；作用機制

潰瘍性結腸炎（ulcerative colitis，UC）是一種以血性腹瀉為臨床表現的累及結直腸的慢性炎性腸病，其發病機制與遺傳易感性、上皮屏障缺陷、免疫失調和環境因素有關[1]。現代醫學常采用氨基水楊酸、糖皮質激素、免疫抑制劑等藥物治療，但可能導致諸多不良反應[2]。中醫藥治療UC療效肯定，且具有多靶點整體調節、療效穩定、不良反應少等優勢。

真人養臟湯源自《太平惠民和劑局方》，由訶子、肉豆蔻、人參、白術、白芍、木香、肉桂、當歸、甘草等組成，具有溫補脾腎、澀腸固脫的功效，用于治療慢性UC有顯著療效[3-7]。實驗研究表明，真人養臟湯能上調白細胞介素-10（IL-10）、Toll樣受體2（TLR2），下調腫瘤壞死因子（TNF）、核轉錄因子-κB（NF-κB）等水平，同時能升高緊密連接相關蛋白閉鎖小帶蛋白1（ZO-1）、閉鎖蛋白（occludin）含量，從而減輕UC大鼠結腸黏膜炎癥，發揮保護UC大鼠結腸黏膜屏障的作用[8-10]。本研究利用網絡藥理學方法分析真人養臟湯治療UC的物質基礎和分子機制，以期為臨床及進一步實驗研究提供思路和依據。

1 資料與方法

1.1 真人養臟湯活性成分及其靶點的篩選

利用中藥系統藥理學數據庫與分析平臺（TCMSP，https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php）獲取真人養臟湯9味中藥的活性成分，以口服生物利用度（OB）≥30%、類藥性（DL）≥0.18為條件篩選主要活性成分。因甘草在方中為調和藥，其成分較多，為方便研究，故對其加用藥動學參數：脂水分配系數（AlogP）＜5、H鍵供體數量（Hdon）＜5、H鍵受體數量（Hacc）＜5、腸上皮通透性（Caco-2）≥-0.40，以納入藥理性質更突出的成分進行研究[11]。并結合文獻，篩選出OB或DL雖低，但活性和含量較高的成分。將所篩選的活性成分借助TCMSP獲取對應的藥物靶點，將結果導入UniProt數據庫（http://www.uniprot.org/）轉化為規范的基因名。

1.2 潰瘍性結腸炎相關靶點的篩選

在GEO數據庫中搜索“ulcerative colitis”，下載編號為GSE87466的芯片數據。本研究選取48個樣本（21例健康人和27例廣泛性UC患者的結腸黏膜組織樣本）處理分析。此外，檢索GeneCards（https://www.genecards.org/）、DisGeNET（https:// www.disgenet.org/）、PharmGKB（https://www. pharmgkb.org/）、DrugBank（https://go.drugbank. com/）4個數據庫，以確保數據更具全面性及可靠性。

1.3 蛋白相互作用網絡的構建

利用R軟件獲取藥物與UC的交集靶點，將交集靶點導入STRING數據庫（http://string-db.org/cgi/），借助Cytoscape3.7.2軟件構建蛋白相互作用（PPI）網絡。

1.4 “中藥-成分-關鍵靶點”網絡構建

將交集靶點導入Cytoscape3.7.2，借助CytoNCA插件中的度（Degree）、緊密度（Closeness）等參數篩選節點，將連接度大于等于中位值的節點確定為關鍵靶點。以關鍵靶點與相應的成分構建“中藥-成分-關鍵靶點”網絡，獲取關鍵成分。

1.5 GO功能和KEGG通路富集分析

利用R軟件對交集靶點進行基因本體（GO）和京都基因與基因組百科全書（KEGG）富集分析，過濾條件設置為＜0.05。GO功能富集分析的生物過程（BP）、細胞成分（CC）、分子功能（MF）按照顯著性進行排序，分別選擇GO功能富集的前10條和KEGG通路富集的前40條進行可視化分析。

1.6 分子對接

通過PubChem平臺獲取真人養臟湯關鍵成分的二維結構，基于ChemBio3D 14.0對其進行結構轉化及優化，利用RSCB PDB數據庫（http://www.rcsb.org/）獲取關鍵靶點的蛋白質晶體結構，利用AutoDock Tools 1.5.6和AutoDock Vina軟件進行分子對接。

2 結果

2.1 真人養臟湯活性成分及其靶點

通過檢索TCMSP數據庫和文獻，以OB≥30%、DL≥0.18為條件篩選，獲得真人養臟湯共計111個成分，其中訶子10個、肉桂12個、肉豆蔻11個、人參24個、白術10個、當歸3個、白芍13個、木香7個、甘草22個。剔除重復成分后，共得到82個成分，利用UniProt數據庫匹配得到195個作用靶點。

2.2 潰瘍性結腸炎相關靶點

通過對GSE87466芯片的48個樣本進行差異分析（|logFC|≥1且＜0.05），獲得1060個差異表達基因，并對上調倍數最大的前20個基因和下調倍數最大的前20個基因繪制熱圖。紅色表示上調基因，綠色表示下調基因，黑色表示無明顯差異基因。GeneCards設置score≥4獲得730個靶點，DisGeNET設置score≥0.2獲得75個靶點，PharmGkb獲得15個靶點，DrugBank獲得16個靶點，剔除重復靶點并取交集得到1703個疾病靶點。

2.3 蛋白相互作用網絡

將藥物與UC靶點取交集獲得74個交集靶點，導入STRING數據庫，借助Cytoscape3.7.2軟件構建PPI網絡，見圖1。圖中節點為靶點，Degree值越大則節點越大、顏色越深，表示該節點與其他節點之間的關系越緊密。其中IL6、TNF、IL1B、AKT1、TP53、CXCL8、MMP9、PPARG、PTGS2、JUN、CASP3、HMOX1、CASP8、CASP1等靶點可能起著治療UC的關鍵作用。

圖1 真人養臟湯治療UC的交集靶點PPI網絡

2.4 “中藥-成分-關鍵靶點”網絡

將交集靶點通過CytoNCA插件篩選得到34個關鍵靶點，與相應成分進行網絡構建，見圖2。獲得可能的關鍵成分，見表1。

圖2 真人養臟湯治療UC“中藥-成分-關鍵靶點”網絡

表1 真人養臟湯治療UC的關鍵成分

2.5 GO功能和KEGG通路富集分析結果

將74個交集基因利用R語言進行GO功能和KEGG通路富集分析。得到GO富集條目2035條，其中BP、CC、MF分別1898、31、106條；KEGG通路富集條目144條。

GO功能BP中，基因富集于對脂多糖的反應、對細菌來源分子的反應、對炎癥反應的調控、活性氧類代謝過程等；CC中，基因富集于膜筏、膜微區等；MF中，基因富集于核受體活性、配體激活的轉錄因子活性、細胞因子受體結合等。見圖3。

圖3 真人養臟湯治療UC的GO功能富集分析

KEGG通路主要富集于NF-кB信號通路、TNF信號通路、IL-17信號通路、C型凝集素受體信號通路、EB病毒感染、TLR信號通路、炎癥性腸病、人類巨細胞病毒感染、癌癥蛋白聚糖、NOD樣受體信號通路、HIF-1信號通路、細胞凋亡、耶爾森菌感染、沙門氏菌感染、致病性大腸桿菌感染等。見圖4。

圖4 真人養臟湯治療UC的KEGG富集分析

2.6 分子對接結果

將部分關鍵成分與關鍵靶點進行分子對接驗證。若親和力（affinity）＜-7 kcal/mol，表示結合活性較強；若affinity＜-9 kcal/mol，表示結合活性非常強[12]。由表2可知，大部分關鍵靶點與相關活性成分有較好的結合活性。

表2 真人養臟湯部分關鍵成分與關鍵靶點的結合能

續表2

活性成分靶點基因PDB ID親和力/（kcal/mol） ginsenoside rh2TNF2AZ5-9.2 IL1B6Y8M-7.6 CASP31NME-8.0 CASP11BMQ-7.1 ellipticineCASP31NME-6.6 CASP84PRZ-7.7

3 討論

本研究篩選出真人養臟湯的大部分關鍵成分已通過實驗證實具有治療UC的作用。例如，山柰酚可以通過NF-кB信號通路調控腸上皮炎癥和緊密連接蛋白功能失常[13]。鞣花酸能夠對腸道發揮抗炎作用，可能與下調環氧化酶-2（COX-2）和誘導型一氧化氮合酶（iNOS）的表達及抑制p38 MAPK、NF-κB、STAT3信號通路有關[14]。柯里拉京具有很好的抗腫瘤、抗氧化、抗炎等活性，通過抑制 NF-κB的活化抑制結腸炎癥和腸上皮細胞凋亡[15]。肉桂醛通過調控dectin-1/TLRs/NF-κB通路發揮抑菌和減輕UC小鼠炎癥的作用[16]。其他成分如油酸、玫瑰樹堿等與UC的相關報道較少或未見報道，值得進一步研究。

PPI網絡分析顯示白細胞介素-6（IL6）在網絡中處于核心地位，IL6可以上調結腸組織中信號轉導子和轉錄激活子3（STAT3）介導的miR-214轉錄，而miR-214異常表達則抑制PTEN和PDLIM2基因，使絲-蘇氨酸蛋白激酶（Akt）磷酸化和NF-κB活化[17]。STAT3可以通過下調緊密連接蛋白的水平來破壞腸黏膜屏障的完整性[18]。故真人養臟湯可能通過IL6/STAT3通路來保護腸黏膜屏障。白細胞介素1β（IL1B）是一種與自身免疫性疾病相關的細胞因子，與IL6、TNF-α協同在啟動免疫炎癥反應的級聯反應中發揮重要作用[19]。胱天蛋白酶1（CASP1）的激活是經典細胞焦亡途徑的核心，胱天蛋白酶3（CASP3）可能介導細胞焦亡的發生。細胞焦亡在抵抗致病微生物感染方面發揮重要作用，與UC密切相關[20]。胱天蛋白酶8（CASP8）作為CASP3的上游激活劑，調控細胞凋亡。有研究發現CASP8可以激活NOD樣受體蛋白3（NLRP3）炎性小體和下游的CASP1[21]，進而促進炎癥的發生。血紅素加氧酶1（HMOX1）不僅作為經典的抗氧基因參與機體的抗氧化反應，還通過誘導抗炎細胞因子及與腸道微生物群相互作用而發揮抗UC作用[22]。分子對接提示山柰酚和柯里拉京與HMOX1、人參皂苷rh2與CASP1、玫瑰樹堿與CASP8均具有較好的結合能力，表明山柰酚、柯里拉京、人參皂苷rh2、玫瑰樹堿等關鍵成分可能通過HMOX1、CASP1、CASP8等相應關鍵靶點參與調控細胞焦亡和細胞凋亡，發揮抗炎、抗氧化的作用，值得進一步進行實驗驗證。

GO功能富集分析結果顯示，真人養臟湯主要通過膜筏、膜微區等細胞成分參與脂多糖反應、活性氧代謝、氧化應激的調控等生物學過程，發揮核受體活性、配體激活的轉錄因子活性等分子功能。活性氧生成增加和抗氧化活性降低是炎性腸病的主要發病機制，氧化應激被認為是炎性腸病發生、發展及嚴重程度的潛在重要的致病因素[23]。

KEGG通路富集分析結果顯示的NF-κB、JAK/STAT、PI3K-Akt、MAPK等炎癥信號通路已有大量文獻證實與UC有關[24]，且多條信號通路相互作用并影響NF-κB的活化，NF-κB通路可能在UC相關的通路中處于核心位置。研究表明，UC患者EB病毒、巨細胞病毒感染率會升高，且EB病毒是最常見的病原體，可能更多地參與了炎性腸病的發病[25]。耶爾森氏菌感染可以觸發CASP8依賴性的細胞焦亡[26]。TLR、C型凝集素受體（CLR）、NOD樣受體均是模式識別受體，識別病原體而啟動固有免疫和誘導適應性免疫。CLR在調節腸道微生物群、維持腸內穩態、影響炎性腸病的進展方面發揮重要作用[27]。CLR與TLR協同激活下游信號通路而促進機體抗細菌和真菌感染反應[28]。因此，本研究預測真人養臟湯可能通過感染免疫相關信號通路發揮治療UC的作用。

綜上，真人養臟湯可能通過參與炎癥、感染、細胞凋亡等相關信號通路及生物功能以發揮治療UC的效用，體現了真人養臟湯通過多成分、多靶點、多通路發揮治療作用的特點，仍需進一步進行體內外實驗驗證。

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Analysis on the Mechanism ofDecoction in Treating Ulcerative Colitis Based on Network Pharmacology

YANG Ling-feng1, ZHANG Yu1, XU Yin2, LIN Rui-fang1, YU Bin2*

(1. Hunan University of Chinese Medicine, Changsha 410208, China; 2. The First Hospital of Hunan University of Chinese Medicine, Changsha 410007, China)

To investigate the mechanism ofDecoction in treating ulcerative colitis based on network pharmacology.Active components ofDecoction and corresponding targets were extracted by TCMSP database and relevant literature. The ulcerative colitis-related targets were screened via GEO, DisGeNET, GeneCards, PharmGKB and DrugBank databases, and the intersection targets of drug and disease were obtained. Protein interaction analysis and enrichment analysis on the overlapping targets were undertaken through STRING database and R language. The key components and targets were screened by Cytoscape 3.7.2 software, and verified by molecular docking using AutoDock softwares.A total of 82 active components ofDecoction were screened, including kaempferol, ginsenoside rh2, corilagin, licochalcone a, ellagic acid, formononetin, ginsenoside rf, oleic acid,ellipticine and cinnamaldehyde, and their effects mainly involved 74 targets, including IL6, TNF, ILB, CASP3, HMOX1, CASP8, CASP1, etc. They were mainly related to the signaling pathways, such as NF-κB, C-type lectin receptor, Toll-like receptor, NOD-like receptor, Epstein-Barr virus infection, human cytomegalovirus infection, apoptosis, etc. The results of molecular docking showed that the key componets had strong binding activity with corresponding targets.Decoction may play a role in treating ulcerative colitis by participating in inflammation, infection, apoptosis-related signaling pathways and biological functions.

network pharmacology; GEO database; molecular docking;Decoction; ulcerative colitis; machanism

R259；R285

A

2095-5707(2022)05-0009-06

10.3969/j.issn.2095-5707.2022.05.002

陽凌峰,張彧,徐寅,等.基于網絡藥理學探討真人養臟湯治療潰瘍性結腸炎的作用機制[J].中國中醫藥圖書情報雜志,2022,46(5):9-14.

湖南中醫藥大學中醫學國內一流建設學科（2018－2020年）

陽凌峰，E-mail: yanglingfeng1971@163.com

喻斌，E-mail: yubin410@163.com

（2021-12-28）

（修回日期：2022-01-19；編輯：魏民）