基于iTRAQ技術分析2種典型養(yǎng)殖模式下大口黑鱸肌肉蛋白組表達差異

周 聃， 王 曙， 周冬仁， 盛鵬程， 胡大雁， 周志金

(1.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部淡水漁業(yè)健康養(yǎng)殖重點實驗室/浙江省淡水水產(chǎn)研究所，浙江湖州 313001；2.浙江省湖州市農(nóng)業(yè)科技發(fā)展中心，浙江湖州 313001)

大口黑鱸()，俗名加州鱸魚，太陽魚科、黑鱸屬，肉質(zhì)鮮美，肌間刺較少，深受廣大消費者歡迎，具有廣闊的市場前景。2019年，我國大口黑鱸養(yǎng)殖產(chǎn)量已達47.8萬t，比2018年增長了10.6%。目前，大口黑鱸的主要養(yǎng)殖方式為專養(yǎng)和混養(yǎng)結合的傳統(tǒng)池塘化養(yǎng)殖、網(wǎng)箱養(yǎng)殖和池塘內(nèi)循環(huán)水養(yǎng)殖等模式。IPRA模式(又稱“跑道”養(yǎng)殖)是集成循環(huán)流水養(yǎng)殖、生物凈水、高效集污等技術于一體的新型養(yǎng)殖模式，該模式能夠減少水體污染，改善魚肉肉質(zhì)，方便生產(chǎn)管理，在江蘇、浙江、上海等地區(qū)被廣泛推廣。隨著IPRA養(yǎng)殖技術的推廣，大口黑鱸已成為我國主要的養(yǎng)殖淡水魚品種，為漁業(yè)提質(zhì)增效、農(nóng)業(yè)鄉(xiāng)村振興提供重要支持。

iTRAQ技術是利用同位素標簽標記蛋白基團，結合質(zhì)譜分析，對不同樣品中的蛋白質(zhì)含量比較，確定差異蛋白，并分析其蛋白功能。該技術通量高、精度準、重復性好，已廣泛應用于醫(yī)學、食品科學和微生物學等領域。

對大口黑鱸品質(zhì)研究主要涉及肌肉營養(yǎng)成分、質(zhì)構等表觀特征研究，對其更進一步的蛋白探索較為罕見。本研究采用iTRAQ技術對IPRA養(yǎng)殖和傳統(tǒng)池塘養(yǎng)殖模式下的大口黑鱸進行定量蛋白質(zhì)組學研究，分析2種養(yǎng)殖模式下魚肉蛋白質(zhì)組表達水平差異，并對其差異蛋白質(zhì)生物信息學進行分析，獲得IPRA養(yǎng)殖與傳統(tǒng)池塘養(yǎng)殖模式下大口黑鱸蛋白質(zhì)組表達水平的差異，從而為分析不同養(yǎng)殖模式下鱸魚魚肉品質(zhì)和代謝差異靶標提供基礎資料。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

同齡段IPRA養(yǎng)殖和傳統(tǒng)池塘養(yǎng)殖大口黑鱸(450～500 g/尾)，購于湖州南潯某養(yǎng)殖場，同一飼料，養(yǎng)殖時間為2019年3—10月。每組取3尾魚，0.5 h內(nèi)運回實驗室，采用自來水清洗，取其背部魚肉，液氮速凍，-80 ℃貯存?zhèn)溆谩?/p>

8-plex iTRAQ試劑盒，購自美國AB Sciex公司；PMSF，購自上海生工生物工程股份有限公司；丙酮，購自美國J.T.Baker公司；胎牛血清標準品BSA、TCEP、MMTS、三乙基碳酸氫銨緩沖液、氨水，購自美國Sigma公司；胰酶，購自美國Promega公司；乙腈、甲酸，購自美國Thermo公司。

1.2 儀器與設備

真空干燥儀冷凍離心機(珠海黑馬醫(yī)學儀器有限公司)；超聲儀(寧波新芝生物科技股份有限公司)；分光光度計(上海光譜儀器有限公司)；低溫離心機(珠海黑馬醫(yī)學儀器有限公司)；恒溫箱(上海一恒科學儀器有限公司)；液相色譜LC-20AD(日本Shimadzu公司)；液相色譜Dionex Ultimate 3 000 RSLCnano、質(zhì)譜儀Q Exactive(美國Thermo Scientific公司)。

1.3 試驗與方法

1.3.1 蛋白質(zhì)提取 稱取約2 g魚肉樣品置于預冷研缽內(nèi)，充分研磨至粉末狀態(tài)，加入1 mL裂解液L3 SDS(使用前加1×PMSF)，超聲(功率500 W，間隔1.5 s，時間1 s，超聲5 min)，離心20 min(4 ℃，12 000 r/min)，收集上清液分裝，每管250 μL，加入1 mL丙酮，-20 ℃過夜。離心20 min(4 ℃，12 000 r/min)，棄上清，干燥。采用Bradford法，對蛋白質(zhì)進行定量。

1.3.2 蛋白FASP酶解及iTRAQ試劑標記 取200 μg蛋白溶液，加入蛋白質(zhì)量比1/50的胰蛋白酶，37 ℃過夜；次日加入質(zhì)量比1/100胰蛋白酶，37 ℃ 反應4 h，離心20 min(4 ℃，12 000 r/min)。加入50 μL 0.5 mol/L TEAB，離心20 min(4 ℃，12 000 r/min)，獲得酶解液，利用iTRAQ試劑盒進行標記，具體見表1(傳統(tǒng)池塘養(yǎng)殖標記為CT，IPRA養(yǎng)殖標記為PD)，下同。

表1 樣本及標記物對照

1.3.3 液相分離及質(zhì)譜鑒定 采用流動相A(HO，pH值=10)和流動相B(80% ACN，pH值=10)以0.2 mL/min流速進行梯度洗脫；洗脫條件為：0～5 min，5%B；5～10 min，5%～10%B；10～60 min，10%～40%B；60～65 min，40%～95%B；65～75 min，保持95%B；75～85 min，95%～5%B。在 214 nm 吸光度下監(jiān)測洗脫過程，根據(jù)峰型和時間收取20個組分，每個組分取3 μg進行二維液相色譜分離。流動相分別為A(0.1%甲酸)，B(0.1%甲酸，80%ACN)，洗脫條件為：0～5 min，5%B；5～8 min，5%～10%B；8～40 min，10%～30%B；40～45 min，30%～35%B；45～50 min，35%～90%B；50～55 min，保持90%B；55～56 min，90%～5%B；56～65 min，保持5%B。每個組分分析時間為 65 min，流速為300 nL/min。

分離后的肽段進入質(zhì)譜儀檢測，一級質(zhì)譜參數(shù)：分辨率為70 000，最大離子強度為3e6，最大注入時間為100 ms，掃描范圍為350～1 800；二級質(zhì)譜參數(shù)：分辨率為17 500，最大離子強度為5e4，最大注入時間為120 ms，母離子選擇20個TopN，碰撞能量NCE為30。

1.3.4 蛋白鑒定和生物信息學分析 在Uniprot 數(shù)據(jù)庫中，對肽段的質(zhì)譜信息進行檢索。將113、114、115混合作為池塘養(yǎng)殖組(CT)；116、118、119混合作為IPRA養(yǎng)殖組(PD)。將蛋白比率≥20或≤0.05除去。對其進行檢驗，<0.05，平均比率≥1.5或≤0.667為上調(diào)或下調(diào)差異蛋白，并進行GO、KEGG代謝通路和STRING網(wǎng)絡通路分析。

2 結果與分析

2.1 蛋白質(zhì)鑒定

在大口黑鱸魚肉中共鑒定出置信度在95%以上的蛋白質(zhì)1 484個。2種養(yǎng)殖模式下大口黑鱸檢測出差異蛋白152個，其中，上調(diào)蛋白98個，下調(diào)蛋白54個。蛋白表達豐度分布見圖1。

2.2 GO功能分析

由圖2可知，對152個差異蛋白進行GO 注釋，其中，主要參與的分子功能有6個，包括：結合(85個)、催化活性(64個)、結構分子活性(14個)、轉(zhuǎn)運活性(8個)、分子功能調(diào)節(jié)劑(8個)、分子載體活性(3個)；細胞位置2個，包括細胞解剖實體(84個)、蛋白質(zhì)復合體(37個)；生物過程14個，其中蛋白數(shù)量較高的主要是細胞過程(58個)、代謝過程(49個)、細胞定位(14個)、生物調(diào)節(jié)(10個)。

2.3 差異蛋白通路分析

KEGG代謝通路分析結果見表2。由表2可知，差異蛋白一共參與142個信號轉(zhuǎn)導通路。其中，主要的代謝通路包括次生代謝產(chǎn)物的生物合成(26個)、肌動蛋白細胞骨架調(diào)節(jié)(16個)、碳代謝(16個)、蛋白質(zhì)消化吸收(13個)、氨基酸的生物合成(12個)、糖酵解(11個)、氧化磷酸化(6個)、檸檬酸循環(huán)(6個)、嘌呤代謝(5個)、鈣信號通路(5個)。

表2 兩種養(yǎng)殖模式下大口黑鱸差異蛋白途徑富集分析

2.4 目標差異蛋白確定

根據(jù)上述差異蛋白分析情況及相關文獻資料，由表3可知，篩選得魚肉品質(zhì)密切相關的28個目標差異蛋白，主要分成6類，分別為肌動蛋白細胞骨架調(diào)節(jié)8個(上調(diào)5個，下調(diào)3個)、糖酵解8個(均上調(diào))、檸檬酸循環(huán)5個(均上調(diào))、氧化磷酸化3個(均上調(diào))、鈣信號通路3個(上調(diào)2個，下調(diào)1個)和熱休克1個(上調(diào))。

表3 兩種養(yǎng)殖模式下大口黑鱸目標差異蛋白

2.5 目標差異蛋白STRING網(wǎng)絡通路分析

STRING網(wǎng)絡數(shù)據(jù)庫信息全面、操作簡便，廣泛運用于蛋白質(zhì)網(wǎng)絡結構分析。由圖3可知，在28個目標蛋白質(zhì)中，有24個蛋白存在相互作用，共162個相互關系，形成了一個多中心互作網(wǎng)絡。各蛋白間通過多條通路進行調(diào)節(jié)，中心蛋白除與周邊蛋白間存在相互關系外，與其他中心蛋白間也存在著相互關系。

3 討論與結論

魚肉是優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)來源，營養(yǎng)價值豐富。蛋白質(zhì)在生命活動中起著重要作用，其結構和含量變化影響各類生理生化反應，如細胞凋亡、糖酵解反應、信號轉(zhuǎn)導等，從而對魚肉品質(zhì)產(chǎn)生相應的影響。因此，通過研究不同養(yǎng)殖模式下大口黑鱸魚肉蛋白質(zhì)差異對提高魚肉品質(zhì)及調(diào)控具有深遠意義。

結果顯示，IPRA養(yǎng)殖的大口黑鱸與傳統(tǒng)池塘養(yǎng)殖的大口黑鱸相比，共有差異蛋白152個，其中，上調(diào)98個，下調(diào)54個；根據(jù)條件，篩選得魚肉品質(zhì)密切相關的目標差異蛋白28個，主要分為6類，分別為肌動蛋白細胞骨架調(diào)節(jié)、糖酵解、檸檬酸循環(huán)、氧化磷酸化、鈣信號通路和熱休克蛋白。其中，與肌動蛋白細胞骨架調(diào)節(jié)有關的目標差異蛋白共有8個，分別為6個肌球蛋白重鏈(MHC)、1個根蛋白(Radixin)和1個肌球蛋白輕鏈-2(MYL2)；與糖酵解有關的目標差異蛋白有8個，分別為葡萄糖-6-磷酸異構酶、ATP依賴性6-磷酸果糖激酶、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(2個)、磷酸甘油酸激酶、磷酸甘油酸變位酶、2-磷酸--甘油酸氫裂解酶和-乳酸脫氫酶；與檸檬酸循環(huán)(TCA循環(huán))有關的目標差異蛋白有5個，分別為丙酮酸脫氫酶復合物乙酰基轉(zhuǎn)移酶組分、蘋果酸脫氫酶、異檸檬酸脫氫酶和烏頭酸水合酶(2個)；與氧化磷酸化的目標差異蛋白有3個，均與細胞色素c氧化酶有關；與鈣信號通路有關的目標差異蛋白有3個，分別為鈣調(diào)素結合蛋白、肌鈣蛋白C(TnC)和鈣轉(zhuǎn)運ATP酶蛋白；與熱休克(HSP)有關的目標差異蛋白有1個，為HSP60。

魚肉肌纖維分慢收縮型、快收縮型和中間型3類。慢收縮型纖維屬有氧代謝型肌纖維，含有豐富的線粒體、細胞色素和肌球蛋白、顯紅色，主要與慢速游泳有關。快收縮型纖維屬酵解代謝型肌纖維，細胞色素或肌球蛋白含量較少、顯白色，主要與快速突然游泳有關。中間型纖維位于兩者之間，呈粉紅色，屬于過渡類型。

MHC是指沿著肌肉纖維排列的細絲，通過收縮、保持和控制釋放控制肌肉運動，是負責運動的主要蛋白。2種養(yǎng)殖模式下MHC差異均為快收縮型纖維差異，這主要與流水運動下糖酵解代謝差異有關。由于處于流水運動下，細胞形態(tài)變化復雜，快收縮性MHC蛋白發(fā)生復雜變化(3個上調(diào)，3個下調(diào))。根蛋白能夠連接肌動蛋白，影響細胞生長、遷移、分裂及信號轉(zhuǎn)導等功能。MYL2為調(diào)節(jié)性輕鏈，能夠影響肌球蛋白重鏈上ATP 酶的活性，使肌纖維的類型出現(xiàn)轉(zhuǎn)變，影響肌肉生長。IPRA養(yǎng)殖與傳統(tǒng)池塘養(yǎng)殖相比，其魚肉根蛋白和MYL2表達均明顯上調(diào)，這可能導致IPRA養(yǎng)殖的魚體肌肉在肌纖維排布上更加致密，纖維直徑更加粗壯，從而使肉質(zhì)品質(zhì)高于池塘養(yǎng)殖的魚體。

IPRA養(yǎng)殖與傳統(tǒng)池塘養(yǎng)殖相比，魚肉中與糖酵解有關的8個差異蛋白表達均明顯上調(diào)，表明其具有更強的糖酵解能力。在牛、羊肉中有研究表明，糖酵解能力與其肉質(zhì)品質(zhì)呈反比。哺乳動物肌肉纖維數(shù)在幼期就已固定，然而魚類生長過程中持續(xù)有快速收縮型纖維補充。此外，Sun等還研究發(fā)現(xiàn)，葡萄糖-6-磷酸異構酶具有通過抑制絲氨酸蛋白酶(MBSP)活性來防止肌原纖維分解的功能。IPRA養(yǎng)殖的大口黑鱸具有較強的糖酵解能力，這可能與其長期處于流水運動狀態(tài)有關。在檸檬酸循環(huán)中，糖類、脂肪、蛋白質(zhì)會分解產(chǎn)生能量貯存在ATP中，從而供給生物體。檸檬酸循環(huán)過程中發(fā)生的反應會影響肉質(zhì)的嫩度及脂肪含量。IPRA養(yǎng)殖的大口黑鱸與傳統(tǒng)池塘養(yǎng)殖相比，與檸檬酸循環(huán)有關的5個差異蛋白表達均明顯上調(diào)，表明其具有更強的檸檬酸循環(huán)能力，同樣可能與其長期處于流水運動狀態(tài)有關。

細胞色素c氧化酶是終端氧化酶，多存在于線粒體中，含有血紅素，影響肌肉顏色。IPRA養(yǎng)殖的大口黑鱸與傳統(tǒng)池塘養(yǎng)殖相比，與氧化磷酸化有關的3個細胞色素C氧化酶差異蛋白表達均明顯上調(diào)，這可能是由于長期處于流水運動，需要更高的代謝，從而使肌纖維中的與色澤有關的肌纖維發(fā)生改變。

鈣調(diào)素結合蛋白是通過抑制肌漿中Ca釋放來介導Ca信號傳遞，從而調(diào)節(jié)細胞生理功能。TnC是與鈣結合的靶分子，能夠調(diào)控骨骼肌收縮。TnC通過與Ca結合，產(chǎn)生應激反應，促進蛋白合成和肌肉增長。鈣轉(zhuǎn)運ATP酶是影響鈣離子轉(zhuǎn)運的重要蛋白，其活性越高，越容易釋放Ca。Ca的釋放會使肌肉不可逆收縮，導致肉的含水性和嫩度下降。在3個目標差異鈣信號通路調(diào)節(jié)蛋白中，IPRA養(yǎng)殖的大口黑鱸與傳統(tǒng)池塘養(yǎng)殖相比，鈣調(diào)素結合蛋白和TnC表達均上調(diào)，而鈣轉(zhuǎn)運ATP酶表達下調(diào)，表明IPRA養(yǎng)殖的大口黑鱸魚肉Ca結合能力較強，釋放較少。

HSP蛋白是機體在應激條件下迅速合成的一類蛋白，其保守性和應激性較高，可作為分子伴侶與不同的多肽鏈非特異性結合，催化介導蛋白質(zhì)特定構象的形成。HSP60是分子量約為60 ku的一個HSP蛋白，能夠促進脂肪分解，與肉的嫩度密切關聯(lián)。IPRA養(yǎng)殖的大口黑鱸與傳統(tǒng)池塘養(yǎng)殖相比，其HSP60表達明顯上調(diào)，反映了IPRA養(yǎng)殖的鱸魚其耐熱應激性要好于傳統(tǒng)池塘養(yǎng)殖。

綜上所述，與傳統(tǒng)池塘相比，IPRA養(yǎng)殖的大口黑鱸肌肉中糖酵解、TCA循環(huán)、氧化磷酸化、鈣離子結合以及抗應激能力均顯著加強，表明IPRA養(yǎng)殖通過加強一定的運動，提高了魚體代謝，從而改善了魚肉營養(yǎng)和品質(zhì)。