高效液相色譜法測蜂蜜中的4種水溶性糖

彭禮枚，譚麗君

（1.廣電計(jì)量檢測（湖南）有限公司，湖南長沙 410000；2.中國電建集團(tuán)中南勘測研究院有限公司，湖南長沙 410000）

目前，測定蜂蜜中的水溶性糖的方法主要有高效液相色譜法[1-3]（檢測器主要有示差折光檢測器和蒸發(fā)光散射檢測器等）、化學(xué)法和離子色譜法[4-6]等。本文采用高效液相色譜法示差折光檢測器檢測蜂蜜中的4種可溶性糖，該方法具有簡單、準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料

蜂蜜樣品，市售。

1.2 儀器和試劑

HP-1200 高效液相色譜儀（美國安捷倫公司）；HY-5 回旋式振蕩器（江蘇金域國勝實(shí)驗(yàn)儀器廠）；分析天平（Sartourius CP224S，Max=220 g，d=0.1 mg）；

乙腈（MERCK KGaA）、果糖、葡萄糖、蔗糖和麥芽糖標(biāo)準(zhǔn)品（均為色譜純）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

用分析天平準(zhǔn)確稱取1.000 0 g 果糖、葡萄糖、蔗糖和麥芽糖標(biāo)準(zhǔn)品于燒杯中，用去離子水溶解，全被轉(zhuǎn)移至1 000 mL 容量瓶中，用去離子水定容到刻度，配制成1 000.0 mg·L-1的標(biāo)準(zhǔn)儲備液。用移液管移取10.00 mL 標(biāo)準(zhǔn)儲備液至100 mL 容量瓶中，配制成100.0 mg·L-1的標(biāo)準(zhǔn)使用液，分別移取0.05 mL、0.10 mL、0.20 mL、0.50 mL 和1.00 mL的標(biāo)準(zhǔn)使用液于10.0 mL 容量瓶中，用去離子水定容，配制成質(zhì)量濃度分別為0. 5 mg·L-1、1.0 mg·L-1、2.0 mg·L-1、5.0 mg·L-1和10.0 mg·L-1系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.3.2 色譜條件

液相色譜儀：安捷倫1200；色譜柱：Waters XBridgeTM Amide 柱，膜厚3.5 μm，內(nèi)徑4.6 mm，長250 mm；流動相：70%乙腈水溶液（等度洗脫15 min）；流速：0.8 mL·min-1；柱溫：85 ℃；檢測器：示差折光檢測器（35 ℃）。

1.3.3 樣品處理

準(zhǔn)確稱取樣品0.250 0 g 于50 mL 錐形瓶中，加入20 mL 乙腈水萃取溶液（1 ∶1），振蕩器上振蕩40 min，取上清液到離心管，以2 000 r·min-1離心20 min，取上層清液，用0.45 μm 微孔濾膜過濾到色譜瓶，進(jìn)樣。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件的確定

2.1.1 流動相選擇

用乙腈和水二元流動相在線混合，色譜基線波動較大，這與示差折光檢測器對流動相密度、溫度變化比較敏感，而液相色譜泵無法使兩種流動相在線即時充分混合均勻有關(guān)。因此，使用預(yù)混合好的乙腈水溶液，色譜基線穩(wěn)定。同時，本實(shí)驗(yàn)也分別考察了不同比例（4 ∶6、5 ∶5、6 ∶4、7 ∶3 和8 ∶2）乙腈水溶液（體積比）作為流動相的情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，乙腈在流動相中的比例增大，可有效改善色譜峰形，有利于各組分的基線分離，但乙腈比例增加不利于糖的溶解，分析時間也顯著延長。當(dāng)增加流動相中水的比例時，分析時間變短。但水的比例過大，組分峰相互靠近，特別是果糖與葡萄糖不能很好地分離。因此，綜合考慮分離效果、分析時間等因素，本實(shí)驗(yàn)選擇乙腈-水（7 ∶3，V∶V）作為流動相。

2.1.2 柱溫選擇

本文考察了不同柱溫(35 ℃、45 ℃、55 ℃、65 ℃、75 ℃和85 ℃)下混合糖溶液的分離效果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在低溫時（35 ℃，45 ℃），葡萄糖和果糖峰形不能分開，且麥芽糖的峰形拖尾。隨著溫度的升高，麥芽糖峰形拖尾現(xiàn)象改善，葡萄糖和果糖也能很好地分開，出峰時間也明顯縮短。因此，選擇85 ℃的柱溫為實(shí)驗(yàn)最佳柱溫。

2.1.3 流動相流速的選擇

本文考察了不同流動相流速（0.5 mL·min-1、0.6 mL·min-1、0.7 mL·min-1、0.8 mL·min-1、0.9 mL·min-1和1.0 mL·min-1）對樣品分離效果的影響。結(jié)果表明，流速為0.9 mL·min-1和1.0 mL·min-1時，柱 壓 過 高；流 速 為0.5 mL·min-1、0.6 mL·min-1和0.7 mL·min-1時，樣品中的糖不能很好地分離，且分離時間也較長。在流速為0.8 mL·min-1時，樣品能夠很好地分離，且分離時間短。因此，選擇流動相流速為0.8 mL·min-1。

2.2 前處理?xiàng)l件的選擇

2.2.1 超聲提取和振動提取的對比

為選擇適宜的提取方式，在其他條件不變的情況，對蜂蜜樣品進(jìn)行了超聲和振蕩提取實(shí)驗(yàn)，提取時間為40 min。由表1 可知，兩種方法提取的糖量相當(dāng)。由于超聲提取噪聲污染大，故本實(shí)驗(yàn)采用振蕩提取。

表1 超聲提取和振蕩提取的糖量表（單位：%）

2.2.2 萃取時間的確定

實(shí)驗(yàn)考察了不同振蕩提取時間（10 min、20 min、30 min、40 min 和50 min）對水溶性糖含量的影響。由圖1 可知，提取時間在10 ～40 min 時，水溶性糖含量逐漸增加，在提取時間為40 min 時達(dá)到最大值，當(dāng)提取時間為50 min 時水溶性糖含量反而降低，所以選擇40 min 為最佳的提取時間。

圖1 不同萃取時間提取的水溶性糖含量圖

2.2.3 萃取溶劑的選擇

大多數(shù)研究均選用水作為糖的萃取溶劑。為選擇適宜的萃取溶劑，實(shí)驗(yàn)分別用100%水、50%乙腈水溶液、60%乙腈水溶液、70%乙腈水溶液和80%的乙腈水溶液作為萃取溶劑對果糖、葡萄糖、蔗糖和麥芽糖等4種水溶性糖標(biāo)樣進(jìn)行溶解與色譜分離實(shí)驗(yàn)。由圖2 可知，用水溶解這4種糖標(biāo)樣時，其色譜峰分離度差，峰形變寬且有拐點(diǎn)；用60%乙腈水溶液、70%乙腈水溶液和80%乙腈水溶液作為萃取溶劑時，水溶性糖溶解度降低；用50%乙腈水溶液作為萃取溶劑，4種糖的溶解均較好，而且在選定的液相條件下，色譜峰分離好，同時在50%乙腈作為萃取溶劑時，水溶性糖的含量最高，因此用50%乙腈水溶液作為萃取溶劑。

圖2 不同比例的萃取溶劑對水溶性糖提取量的影響

2.3 蜂蜜中可溶性糖含量的測定

由表2 可知，1 號樣品的總糖含量最高，達(dá)84.62%；3 號樣品次之，達(dá)81.75%；2 號樣品最低，達(dá)79.72%；蜂蜜中主要含有果糖、葡萄糖、蔗糖和麥芽糖4種水溶性糖，其中果糖含量均為最高；RSD均在5%以下，實(shí)驗(yàn)重復(fù)性好。

表2 蜂蜜中各單糖含量表（單位：%）

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線及檢出限

取上述標(biāo)準(zhǔn)使用液，分別配制成一系列的標(biāo)準(zhǔn)溶液，在1.3.2 的實(shí)驗(yàn)條件下，以峰面積為縱坐標(biāo)、質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)繪制工作曲線，線性方程、相關(guān)系數(shù)見表3。以空白3 倍信噪比計(jì)算出各目標(biāo)化合物的檢出限，以3 倍檢出限確定方法的定量限。由表3可知，4種目標(biāo)化合物的檢出限為0.04 ～0.28 mg·L-1。

表3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性方程和相關(guān)系數(shù)以及檢出限表

2.5 方法的回收率

按1.3.2 實(shí)驗(yàn)方法在空白樣品中進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，每個水平重復(fù)5 次，回收率和測定值的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差結(jié)果見表4。由表4 可知，果糖、葡萄糖、麥芽糖和蔗糖的回收率均高于99%，表明本方法比較準(zhǔn)確。

表4 方法的回收率表

3 結(jié)論

本方法重復(fù)性好，回收率高，樣品前處理簡單，可在短時間內(nèi)處理大批量的樣品，適合大量蜂蜜中的葡萄糖、果糖、蔗糖和麥芽糖的測定。