高效液相色譜法測定糕點中的富馬酸二甲酯和納他霉素

張慧瓊，鄭陸紅，黃柳霞，陳麗香

（1.廣東省食品工業(yè)公共實驗室，廣東廣州 511442；2.廣東省食品工業(yè)研究所有限公司，廣東廣州 511442；3.廣東省質(zhì)量監(jiān)督食品檢驗站，廣東廣州 511442）

糕點食品的保質(zhì)期較短，在儲存、流通過程中易因微生物大量繁殖而引起食品的腐敗和變質(zhì)。生產(chǎn)企業(yè)會在生產(chǎn)中添加苯甲酸鈉、山梨酸鉀、富馬酸二甲酯和納他霉素等防腐劑來保證糕點食品的質(zhì)量和風味[1]。富馬酸二甲酯又稱胡索酸二甲酯，化學名為反丁烯二酸二甲酯，俗稱防霉保鮮劑霉克星1號。因其高效、持久穩(wěn)定且應用范圍廣泛，所以常被用于果蔬食品、服飾、化妝品、中藥材等的防腐、防霉、保鮮方面。富馬酸二甲酯有毒，對人體有腐蝕性和致過敏性，可經(jīng)食道吸入對人體腸道、內(nèi)臟產(chǎn)生腐蝕性損害，尤其對兒童的生長發(fā)育造成了重大的危害[2]。納他霉素又稱匹馬霉素，能有效抑制各種酵母菌、霉菌的生長，又能抑制真菌毒素的產(chǎn)生，可廣泛用于乳酪、肉制品、糕點等食品的防腐保鮮及真菌治療[3]。雖然我國將富馬酸二甲酯列為第二種違禁食品添加劑，《食品安全國家標準 食品添加劑使用標準》（GB 2760—2014）[4]規(guī)定，納他霉素的最大使用量為0.3 g·kg-1，且為表面使用。但不良廠家、不法商販為降低成本、延長貨期，在月餅、面包等常見的糕點食品中違規(guī)使用，因此加強對糕點中富馬酸二甲酯和納他霉素的檢測評價是十分重要的。目前國內(nèi)檢測富馬酸二甲酯和納他霉素的標準方法是高效液相色譜法，但是兩個項目分別檢測，而糕點的檢測任務繁重，且富馬酸二甲酯的實驗過程需要配制多種試劑，耗時長、成本高。因此，本文基于快速簡便篩查的目的，研究了同時測定糕點中富馬酸二甲酯和納他霉素的含量的方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

某品牌糕點，市售；綠豆糕中富馬酸二甲酯含量檢測內(nèi)部質(zhì)控樣品，86.46 mg·kg-1：大連中食國實檢測技術有限公司；富馬酸二甲酯標準品（純度99.70%）：Dr.Ehrenstorfer 公司；納他霉素標準品（純度91.1%），BePure 公司；甲醇（色譜純），上海星可高純?nèi)軇┯邢薰荆粚嶒炇矣盟疄镸illi-Q Advantage A10 制備的一級水，Millipore 公司；0.22 μm有機相濾膜，艾杰爾。

1.2 儀器與設備

Agilent 1260 Infinity II 高效液相色譜儀，配有二極管陣列檢測器（DAD），美國安捷倫科技有限公 司；TC-C18色 譜 柱（150 mm×4.6 mm，5 μm），美國安捷倫科技有限公司；超聲波清洗機（SB25-12DT），寧波新芝生物科技股份有限公司；漩渦混合器（IKA MS 3 basic），德國IKA 公司；純水機（Milli-Q Advantage A10），默克密理博公司；電子天平，十萬分之一，梅特勒-托利多（上海）有限公司。

1.3 溶液配制

1.3.1 標準儲備溶液的配制

精確稱取富馬酸二甲酯標準物質(zhì)10.03 mg，用甲醇充分溶解，并稀釋定容至10 mL 容量瓶，搖勻，配制成1.000 mg·mL-1的標準儲備液，貯存于0 ～4 ℃冰箱中，有效期90 d。

精確稱取納他霉素標準物質(zhì)10.98 mg，用甲醇充分溶解，并稀釋定容至10 mL 容量瓶，搖勻，配制成1.000 mg·mL-1的標準儲備液，貯存于0 ～4 ℃冰箱中，有效期90 d。

1.3.2 標準混合使用液的配制

從富馬酸二甲酯標準儲備液（1.000 mg·mL-1）和納他霉素標準儲備液（1.000 mg·mL-1）中分別吸取1 mL 至同一個10 mL 容量瓶中，用甲醇定容，混勻，配制成100 μg·mL-1的標準混合使用液。

1.3.3 標準系列溶液的配制

從富馬酸二甲酯和納他霉素的標準混合使用液（100 μg·mL-1）中 分 別 吸 取0.004 mL、0.010 mL、0.050 mL、1.000 mL、5.000 mL、10.000 mL、20.000 mL 至100 mL 容量瓶，用甲醇水溶液（75+25，V/V）定 容，配 制 成0.004 μg·mL-1、0.010 μg·mL-1、0.050 μg·mL-1、1.000 μg·mL-1、5.000 μg·mL-1、10.000 μg·mL-1和20.000 μg·mL-1的標準系列溶液。

1.4 試樣前處理

糕點均勻粉碎后，準確稱取試樣2.00 g，置于50 mL 離心管中，加入75%甲醇15 mL，渦旋搖勻3 min，再置于超聲波清洗機中超聲提取30 min，再用75%甲醇定容至25 mL，后置于離心機中以4 000 r·min-1，離心5 min，上清液過0.22 μm 有機濾膜，收集濾液約2 mL 供高效液相色譜儀分析測定。

1.5 色譜條件

Agilent TC-C18色 譜 柱（150 mm×4.6 mm，5 μm），以甲醇與水（70 ∶30，V/V）為流動相，流速1.0 mL·min-1，進樣量10 μL，波長210 nm 和304 nm，二極管陣列檢測器檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 液相色譜條件的選擇

2.1.1 流動相的選擇

參考相關文獻，本實驗采用甲醇與水作為流動相[5]，考察了甲醇和水的不同比例，甲醇∶水（V∶V）為90 ∶10、85 ∶15、80 ∶20、75 ∶25、70 ∶30、65 ∶35、60 ∶40、55 ∶45、50 ∶50 和45 ∶55。經(jīng)過反復的試驗，甲醇比例較高時，兩者分不開，且響應不高。本試驗最終選擇甲醇-水70 ∶30 為流動相，能更好地把富馬酸二甲酯、納他霉素洗脫出來，且峰型對稱。富馬酸二甲酯標準溶液的色譜圖見圖1，通過與空白樣品的比較，其保留時間為3.0 min。納他霉素標準溶液的色譜圖見圖2，通過與空白樣品的比較，其保留時間為4.6 min。

圖1 富馬酸二甲酯標準溶液的色譜圖

圖2 納他霉素標準溶液的色譜圖

2.1.2 檢測波長的確認

取10 μg·mL-1富馬酸二甲酯和納他霉素標準儲備液，分別采用DAD 在波長190 ～400 nm 進行掃描，結(jié)果見圖3、圖4。富馬酸二甲酯的最大吸收波長是210 nm，納他霉素的最大吸收波長是304 nm。因此，本實驗選擇210 nm 作為富馬酸二甲酯的檢測波長，選擇304 nm 作為納他霉素的檢測波長。

圖3 富馬酸二甲酯標準溶液的光譜圖

圖4 納他霉素標準溶液的光譜圖

2.2 樣品提取溶劑的優(yōu)化

2.2.1 提取溶劑的選擇

富馬酸二甲酯溶于乙酸乙酯、氯仿、丙酮和醇類，微溶于乙醚和水；納他霉素微溶于水、甲醇，溶于稀酸、冰醋酸，難溶于大部分有機溶劑。駱健美等[6]采用平衡法測定了納他霉素在不同溶液中的溶解度，最終發(fā)現(xiàn)在甲醇中的溶解效果是最好的。由于糕點基質(zhì)油脂比較多，且含有豐富的蛋白，若選用甲醇提取，會使溶于甲醇的一些油脂雜質(zhì)也被帶到溶劑中，造成基線波動，又因選用甲醇水作為流動相，官詠儀等[7]也認為選擇甲醇水作為此兩種物質(zhì)的提取溶劑，能使上機的溶液濃度更接近流動相。因此，本方法選用甲醇-水作為提取富馬酸二甲酯和納他霉素的溶劑。

2.2.2 提取溶劑比例的確認

參考相關文獻[5-6]，本試驗采用甲醇-水作為提取溶劑，考察了甲醇和水的不同比例，甲醇∶水（V∶V）為0 ∶100、5 ∶95、10 ∶90、15 ∶85、20 ∶80、25 ∶75、30 ∶70、35 ∶65、40 ∶60、45 ∶55、50 ∶50、55 ∶45、60 ∶40、65 ∶35、70 ∶30、75 ∶25、80 ∶20、85 ∶15、90 ∶10、95：5 和100 ∶0，對 富 馬 酸 二 甲 酯 和納他霉素的回收率，結(jié)果如圖5 所示。經(jīng)過反復的試驗，納他霉素在甲醇水的不同比例中，回收率為72%～105%，但富馬酸二甲酯在甲醇比例為70 以下時，回收率均低，在甲醇比例為70 以上時，回收率明顯良好。最終在大量試驗下，且考慮提取溶液的濃度能更接近流動相。因此，本方法選用75%甲醇作為提取富馬酸二甲酯和納他霉素的溶劑。

圖5 甲醇水不同比例分別對富馬酸二甲酯和納他霉素回收率的影響

2.3 方法的線性范圍及檢出限

在上述分析條件下，將標準系列溶液分別進樣10 μL，以標準工作使用液濃度為橫坐標，以峰面積為縱坐標繪制校正曲線，富馬酸二甲酯的線性回歸方程為Y=70.247 5X-2.949 6，相關系數(shù)（r）為0.999 91，線性良好；納他霉素的線性回歸方程為Y=30.507 2X-0.485 4，相關系數(shù)（r）為0.999 92，線性良好。以信噪比S/N=3 時計算本方法的檢出限，S/N=10 時的濃度為定量限，具體見表1。

表1 糕點中富馬酸二甲酯和納他霉素標準樣品的標準曲線方程

2.4 方法回收率試驗

準確稱取不含富馬酸二甲酯和納他霉素的基質(zhì)樣品，分別加入富馬酸二甲酯和納他霉素5 mg·kg-1、125 mg·kg-1、225 mg·kg-13個水平的標準儲備溶液，按照“1.4 試樣前處理”進行加標回收試驗，每個水平做6個平行，測定回收率和精密度，結(jié)果見表2。結(jié)果表明，富馬酸二甲酯的回收率在97%～104%，相對標準偏差在0.71%～0.94%；納他霉素的回收率在95.1%～99.3%，相對標準偏差在0.20%～0.86%，符合《實驗室質(zhì)量控制規(guī)范 食品理化檢測》（GB/T 27404—2008）附錄F 中回收率和精密度的要求。本研究建立的方法具有較高的準確度和精密度，系統(tǒng)誤差小，測定結(jié)果比較準確，分析方法可行性高。

表2 加標回收率試驗結(jié)果（n=6）

2.5 實際樣品的檢測

按照上述方法對含納他霉素糕點和含有富馬酸二甲酯的糕點質(zhì)控樣進行檢測，并與國家標準方法進行比較，結(jié)果見表3。質(zhì)控樣的測試結(jié)果采用“z-比分數(shù)”評價，經(jīng)分析，|Z|≤2，測試結(jié)果滿意。結(jié)果表明，本方法的結(jié)果準確、可靠，適用于糕點中富馬酸二甲酯和納他霉素的同時測定。

表3 實際樣品的檢測

3 結(jié)論

本文建立了一種以高效液相色譜同時測定糕點中的富馬酸二甲酯和納他霉素含量的分析方法，對樣品加入不同水平的儲備溶液，經(jīng)75%甲醇超聲處理后，在優(yōu)化后的高效液相色譜條件下進行上機分析，結(jié)果表明，富馬酸二甲酯和納他霉素均線性良好，且回收率和相對標準偏差也符合分析方法的要求。該法具有樣品簡單處理、測試快速簡便、準確等優(yōu)點，適用于大批量樣品的快速測定。