發(fā)酵乳中乳酸菌含量檢測技術研究進展

趙 航

（巴東縣公共檢驗檢測中心，湖北巴東 444300）

我國食品安全國家標準GB 19302—2010[1]指出酸奶是以生牛羊乳或者乳粉為原料，經(jīng)殺菌，接種嗜熱鏈球菌和德氏乳桿菌保加利亞亞種發(fā)酵制成的產(chǎn)品。酸奶中的乳酸菌含量是衡量酸奶品質(zhì)的一個重要指標，我國國家標準要求發(fā)酵乳中乳酸菌含量不得少于1×106CFU·mL-1。常見的市售發(fā)酵乳中添加的乳酸菌主要是嗜熱鏈球菌和保加利亞乳桿菌。嗜熱鏈球菌為兼性厭氧或微好氧的革蘭氏陽性球菌，是以兩個卵圓型為一對的球菌連成長鏈狀結構，在選擇性培養(yǎng)基上會形成米色的兩頭尖尖的小菌落。保加利亞乳桿菌為兼性厭氧革蘭氏陽性菌，在酸性環(huán)境下的菌體是粗長或者粗短的圓柱狀，兩端圓，在培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)因培養(yǎng)基的種類和培養(yǎng)溫度不同而表現(xiàn)出較大的差異。

1 發(fā)酵乳中乳酸菌含量的檢測技術

1.1 平板培養(yǎng)技術

在食品安全檢驗領域檢測發(fā)酵乳中乳酸菌的方法主要以國家標準方法（以下簡稱國標法）為主，國標法是依照微生物特有的生化特性，選取合適的培養(yǎng)基并給予適宜的培養(yǎng)環(huán)境，依據(jù)菌落特征對相應的菌落數(shù)進行計數(shù)。《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 乳酸菌檢驗》（GB 4789.35—2016）[2]按照樣品制備稱取25 g 樣品加入225 mL 無菌生理鹽水中，取1 mL 混合液逐級稀釋，選擇2 ～3個適宜的連續(xù)稀釋度各1 mL 加入無菌平皿中，分別傾注MC和MRS 瓊脂培養(yǎng)基，傾注MC 的平板計數(shù)嗜熱鏈球菌需要在36 ℃條件下培養(yǎng)72 h，計數(shù)中等偏小、邊緣整齊光滑的紅色菌落，菌落背面是粉紅色。傾注MRS 的平板計數(shù)乳桿菌含量，于36 ℃條件下厭氧培養(yǎng)72 h，選取無片狀生長，菌落數(shù)在30 ～300 的平板計數(shù)，依據(jù)標準中的計算方法算出乳酸菌的菌落數(shù)，以CFU·g-1為單位報告計數(shù)結果。

國標法檢測乳酸菌數(shù)量的優(yōu)點是步驟詳細、操作性強、對人員計數(shù)要求低，但缺點是計數(shù)不準確、耗時長、操作煩瑣以及工作量大，且目前已經(jīng)無法滿足企業(yè)生產(chǎn)的需求，與國際標準不接軌。

1.2 流式細胞技術

流式細胞技術是一種生物學技術，用于對懸浮于流體中的微小顆粒進行計數(shù)和分選。2015年，國際標準化組織頒布了用流式細胞技術測定發(fā)酵產(chǎn)品中乳酸菌數(shù)量的方法標準，我國出入境機構也于2022年頒布了流式細胞技術檢測發(fā)酵產(chǎn)品中乳酸菌的方法，即《乳及乳制品發(fā)酵劑、發(fā)酵產(chǎn)品中乳酸菌計數(shù) 流式細胞儀法》（SN/T 5436—2022）。該標準通過采用對原生質(zhì)體、DNA 和膜電位3個參數(shù)進行染色的方法，觀察活細胞相應參數(shù)的熒光強度變化實現(xiàn)對發(fā)酵乳中活性乳酸菌的計數(shù)。

流式細胞技術的主要原理是通過細菌內(nèi)部的胞內(nèi)酶可以特異性水解相關底物，將底物偶聯(lián)上熒光染料，當?shù)孜镞M入活細胞內(nèi)部后，胞內(nèi)酶水解由流式細胞儀的激光器激發(fā)可以發(fā)出熒光，將待測菌懸液上樣流式細胞儀，以單個微粒的形式通過檢測器，每個微粒的熒光信號疊加，由熒光信號的強度精準計數(shù)菌懸液中微生物的數(shù)量。

流式細胞技術的檢測步驟如下：制備1 ∶10 的樣品均液，并以10 倍梯度逐漸稀釋至1 ∶10 000，在其中加入緩沖液，熒光底物，反應30 min，超聲波干擾離子后取100 ～200 μL 加入流式管中，上機檢測。流式細胞儀可以檢測500 ～20 000個/100 μL的微粒，因此在此過程中要注意選擇合適的稀釋梯度。杜耿記等[3]采用流式細胞技術測試了蒙牛乳業(yè)的5 款酸奶中的乳酸菌含量，并與標準方法進行了比較，結果表明流式細胞法可以準確快速穩(wěn)定地檢測酸奶中乳酸菌的含量，單個樣品的檢測時間僅為5 min，且和國標方法具有一致性。姜凱等[4]也建立了基于流式細胞技術的乳酸菌快速計數(shù)方法，通過實驗優(yōu)化了5(6)-羧基熒光素二乙酸酯和碘化丙啶（Propidium Iodid，PI）2種熒光染料的濃度和作用時間，探究了發(fā)酵乳樣品的測試濃度，并優(yōu)化了儀器的檢測電壓，最終得到了最佳的測試參數(shù)和效果，同樣與現(xiàn)行國家標準方法有顯著正相關關系。他們的研究對于流式細胞技術在發(fā)酵乳檢測中的應用有積極影響，對貨架期較短的非殺菌型發(fā)酵乳和其他活菌乳品生產(chǎn)企業(yè)的產(chǎn)品上市意義重大。

流式細胞檢測技術在發(fā)酵乳檢測中的應用具有明顯的優(yōu)勢，檢測時間短、前期處理加上檢測時間僅需1 ～2 h，準確度和靈敏度高，但流式細胞儀設備較昂貴，對技術人員的要求也比較高，不利于在基層檢測機構中推廣應用。

1.3 熒光定量PCR 技術

熒光定量PCR 技術是基于熒光定量PCR 儀的一種檢測目的基因有無及拷貝數(shù)的基礎分子生物學技術。熒光定量PCR 技術在微生物鑒定上的應用主要是根據(jù)物種的特異性，針對每種微生物的特異性序列設計特異性的探針引物，提取物種DNA 后加入擴增酶和緩沖液，在體外熒光定量PCR 儀內(nèi)實現(xiàn)目的基因的指數(shù)擴增，擴增目的片段的多少可以實時通過熒光染料或者探針熒光的積累被檢測到。王綺等[5]用熒光定量PCR 技術定量檢測了發(fā)酵乳中包括嗜熱鏈球菌、保加利亞乳桿菌在內(nèi)的6種乳酸菌的含量，其準確度優(yōu)于國家標準方法。

相較于前兩種方法，熒光定量PCR 技術在對樣品的前處理方面有較大優(yōu)勢，發(fā)酵乳的乳品基底干擾DNA 的提取，目前有專門針對蛋白含量高的食品樣品DNA 提取試劑盒，價格不高且提取效果較好，獲得濃度和純度俱佳的DNA 是該技術的關鍵。目前發(fā)酵乳生產(chǎn)企業(yè)為了開發(fā)出具有豐富營養(yǎng)價值且口感良好的新產(chǎn)品，往往會在一種產(chǎn)品中添加多種乳酸菌，現(xiàn)有國家標準檢測方法已經(jīng)無法滿足生產(chǎn)企業(yè)的實際需求，而熒光定量PCR 技術可以針對不同的菌種設計特異性引物探針實現(xiàn)對特定菌種的定性定量檢測。

筆者認為可以開發(fā)多重的熒光定量PCR 技術，根據(jù)發(fā)酵乳的添加菌種，選擇對應的擴增體系，結合三代數(shù)字PCR 技術和設備，真正實現(xiàn)對發(fā)酵乳樣品高效準確的定量檢測。

1.4 光譜學技術

光譜學技術因其具有高效無損的特點，在食品檢測中的應用和研究也比較廣泛。其中，原子吸收光譜法多用于檢測各類食品中的金屬元素。在微生物檢測方面，光譜技術的應用還處于研究階段，王綺等[5]基于近紅外光譜和紫外吸收光譜技術開發(fā)了活菌飲料中乳酸菌的定量檢測技術，通過優(yōu)化前處理方法，建立定量分析模型，最終發(fā)現(xiàn)采用傅里葉變換近紅外光譜建立的模型對乳酸菌活菌計數(shù)檢測效果最佳。光譜檢測技術具有高效、無損、便捷等優(yōu)點，并且可以應用于現(xiàn)場無損檢驗，適合監(jiān)督監(jiān)管。但模型的建立較為復雜，需要專業(yè)人員進行操作，且食品樣品基底復雜多變，推廣上難度較大。

2 4種檢測技術的優(yōu)缺點比較

4種檢測技術的優(yōu)缺點具體見表1。每種技術各有優(yōu)劣，但隨著人們對食品安全和品質(zhì)要求的提高，我國監(jiān)管機構的監(jiān)管能力也在進一步提升，檢測領域的技術發(fā)展和人員的專業(yè)水平也在逐年提高，更加準確科學的檢測技術必將取代傳統(tǒng)技術。目前流式細胞技術在乳酸菌檢測上已經(jīng)有相關標準推出，期待新的技術進一步在相關檢測上應用發(fā)展，為食品安全保駕護航。

表1 4種檢測技術優(yōu)缺點比較

3 發(fā)酵乳市場走向預測

乳酸菌不僅可以促進消化，調(diào)節(jié)腸胃，維持腸道菌群平衡，還有保健作用。在大健康時代背景下，人們對乳品質(zhì)量的關注度逐漸增加，發(fā)酵乳作為人們的主要消費奶源，其也是將乳酸菌傳遞給人體的主要食品載體。目前發(fā)酵乳中較常見的乳酸菌有嗜熱鏈球菌和保加利亞乳桿菌，但隨著發(fā)酵乳市場的活躍以及對益生菌研究的不斷深入，一些優(yōu)質(zhì)的益生菌也被添加進發(fā)酵乳中，如鼠李糖乳桿菌、嗜酸乳桿菌、動物雙歧桿菌，干酪乳桿菌以及植物乳桿菌等，這些新菌種的加入豐富了發(fā)酵乳口感，提升了發(fā)酵乳的品質(zhì)[6]。為了滿足消費者需求，進一步引領發(fā)酵乳企業(yè)的良性發(fā)展，相關行業(yè)和部門應進一步加大發(fā)酵乳菌種資源的開發(fā)研究，并結合消費群體的年齡性格特征研發(fā)新產(chǎn)品。

4 結語

目前國家標準檢測方法已經(jīng)無法滿足實際檢測需求，基于分子生物學和細胞生物學的檢測技術在天然活菌檢測上具有顯著的優(yōu)勢，相關學者已針對該類技術在發(fā)酵乳乳酸菌檢驗上的應用開展了相關研究工作，相信在政府相關部門的支持下該技術的廣泛應用指日可待。