納米金比色法檢測乙肝病毒核酸綜合性實驗

溫聰穎， 李 想， 張瑞巧， 李怡敏， 周 亭， 曾景斌

（1.中國石油大學（華東）化學化工學院，重質油國家重點實驗室，山東 青島 266580；2.青島市農業科學研究院，山東 青島 266100）

0 引 言

近年來，納米金由于具有獨特的光學性質、良好的化學穩定性及生物相容性，且易于修飾等特點受到了廣泛關注［7-9］。基于其發展的比色技術操作簡便省時、無需大型儀器，在現場即時檢測中展現出巨大的應用潛力。其檢測原理主要是基于被檢對象引起納米金狀態改變導致溶液變色，從而用裸眼即可判讀檢測結果［10-12］?；诖?，本文以乙肝病毒核酸為模式目標物，利用納米金技術設計了一種病毒核酸的比色檢測法。該法通過在納米金上分別修飾與乙肝病毒核酸兩端互補的DNA序列，利用其與目標核酸通過堿基互補配對實現雜交，形成納米金團聚，使顏色發生從紅色到藍色的明顯變化，從而實現比色檢測。該實驗從材料制備、表征、修飾到應用，內容完整并具有較強的可操作性，融合了材料、化學、生物、醫學等多個學科的理論知識以及相關的實驗方法和技術，并緊密聯系科學前沿，具有較高的綜合性、交叉性和前瞻性，適合在相關專業高年級本科生中開設，有利于高校綜合型創新人才的培養。

1 實驗設計

圖1展示了本實驗的流程、實施方法和預期目標。實驗開始前，學生通過參觀實驗室、查閱文獻、交流討論等方式，熟悉實驗內容；然后實施實驗，包括納米金的制備、DNA修飾及病毒核酸檢測；接著進行數據整理、分析和總結，并撰寫論文；最后以學術答辯的形式進行考核。本實驗通過模擬科學研究的一般步驟，讓學生體驗一套完整的科研訓練過程，能夠極大地培養學生的綜合實驗能力及科研素養。

圖1 實驗流程、實施方法和預期目標

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

試劑：氯金酸、氯化鈉、六水合氯化鎂、二水合檸檬酸三鈉、甲酰胺、鹽酸、硫酸葡聚糖鈉鹽（M.W.500000）、三羥甲基氨基甲烷（Tris）等購自國藥集團化學試劑有限公司，乙肝病毒DNA片段（5′-ATA CCA CAT CAT CCA TAT AAC TGA AAG CCA-3′）、丙肝病毒RNA反轉錄DNA片段（5′-ATC TCC AGG CAT TGA GCG GGT TTA TCC ACG A-3′）、艾滋病毒RNA反轉錄DNA片段（5′-CCA TGA ATT TAG TTG CGC CTG GTC CTT TAA-3′）、乙肝病毒互補DNA片段1（HS-5′-AAA AAA AAAAAATGG ATG ATG TGG TAT-3′）、乙肝病毒互補DNA片段2（HS-5′-AAA AAA AAAAAATGG CTT TCA GTT ATA-3′）購自Invitrogen公司。

儀器：電子天平（奧豪斯儀器有限公司，PWS224ZH／E），離心機（湖南湘儀實驗儀器開發有限公司，TGL-16），動態光散射儀（Malvern ZetaSizer Nano ZS），透射電鏡（日本電子株式會社，JEM-1400），紫外-可見分光光度計（日本島津公司，UV-2450），控溫磁力攪拌器（愛博特科技有限公司，ZNCL-TS），恒溫振蕩器（上海精宏實驗設備有限公司，THZ-312），超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司，KQ2200）。

2.2 納米金的制備

采用檸檬酸鈉還原法制備納米金［13］：取5 mL 24.28 mmol／L的氯金酸溶液，用超純水定容至100 mL，轉移至燒瓶中，在攪拌下加熱回流；待溶液煮沸后向其中迅速加入10 mL新配制的檸檬酸三鈉溶液（38.8 mmol／L），繼續加熱15 min，在此過程中溶液顏色由黃色變為黑色，最后呈現酒紅色，停止加熱，存于4 °C待用。

2.3 乙肝病毒核酸靶向的納米金生物探針構建

采用低pH輔助法［14-16］，通過巰基與金的配位作用，在納米金上修飾巰基化的乙肝病毒核酸的互補DNA片段，兩種片段的修飾方法一致，具體為：在500 μL上述納米金溶液中加入15 μL 100 μmol／L的巰基化DNA片段，渦旋混勻，在恒溫振蕩器上室溫反應5 min，再加入10 μL檸檬酸緩沖溶液（500 mmol／L，pH3.0），繼續反應30 min，將產物離心洗滌3次以除去未反應的DNA片段（離心條件：12 000 r／min，15 min）；最后將產物分散到500 μL Tris緩沖溶液（20 mmol／L，pH 8.0）中，分別命名為探針1、探針2，存于4 °C待用。

2.4 納米金生物探針用于乙肝病毒核酸的檢測

2.4.1 檢測的基本方案

醫療機構是引起醫源性感染的重要場所。醫院消毒是預防醫源性感染的重要措施,消毒與滅菌質量監測又是評價消毒與滅菌效果的重要手段[1]。為了解新鄉市醫療機構消毒與滅菌質量狀況和相關部門進行醫院消毒管理和監督工作提供理論依據,現回顧性分析新鄉市2015-2017年各級醫療機構的消毒監測結果,現統計如下:

首先配制雜交液，在20 mmol／L、pH 8.0 Tris緩沖溶液中加入甲酰胺、硫酸葡聚糖和MgCl2，使其終濃度分別為20%、16%和3.75 mmol／L，再根據實驗需求添加一定量的NaCl，然后將制備的兩種納米金探針與雜交液以體積比3∶3∶4（探針1∶探針2∶雜交液）混合配成檢測工作液，取200 μL工作液與100 μL待檢樣品混合，在恒溫振蕩器上反應，根據實驗需求選擇反應溫度和時間，待反應結束后觀察顏色變化并測定紫外-可見吸收光譜。

2.4.2 檢測條件的優化

采用單因素變量法優化反應溫度、時間和鹽度，所有陽性組乙肝病毒核酸的濃度都設定為0.1 μmol／L，所有空白對照組均加入等體積的超純水，每組實驗均重復3次。

反應溫度的優化：雜交液中NaCl濃度設定為0.3 mol／L，反應分別在25、30、35、40、45 °C下進行，各反應1.5 h后測定吸收光譜，確定最佳溫度。

反應時間的優化：雜交液中NaCl濃度設定為0.3 mol／L，反應溫度設定為最佳溫度，分別孵育1、5、10、30、50、70、90 min后，測定吸收光譜確定最佳時間。

檢測體系鹽度的優化：雜交液中NaCl濃度分別為0.3、0.4、0.5、0.6 mol／L，在最佳溫度下孵育最佳時間，測定吸收光譜確定最佳鹽度。

2.4.3 檢測方法的特異性實驗

在優化后的最佳反應條件下（反應溫度30 °C；反應時間5 min；NaCl濃度0.4 mol／L），分別檢測0.1 μmol／L的乙肝病毒DNA、0.01 mmol／L丙肝病毒的反轉錄DNA、0.01 mmol／L艾滋病毒的反轉錄DNA，并采用超純水作為空白對照組，每組實驗重復3次，反應結束后測定吸收光譜。

2.4.4 檢測方法的重現性實驗

在優化后的最佳反應條件下（反應溫度30 °C；反應時間5 min；NaCl濃度0.4 mol／L），用同一批次制備的探針分別檢測5組0.1 μmol／L的乙肝病毒DNA，測定吸收光譜，計算組內相對標準偏差；采用不同批次制備的探針分別測定5組0.1 μmol／L的乙肝病毒DNA，測定吸收光譜，計算組間相對標準偏差。

2.4.5 不同濃度的乙肝病毒核酸的檢測

在優化后的最佳反應條件下（反應溫度30 °C；反應時間5 min；NaCl濃度0.4 mol／L），分別檢測5×10－3、1×10－2、5×10－2、1×10－1、5×10－1、1 μmol／L的乙肝病毒DNA，測定吸收光譜，以光譜信號對濃度進行線性擬合得到標準曲線，同時測定11組空白樣品的信號，計算標準偏差。

3 結果與討論

3.1 納米金的表征

實驗所制得的納米金溶液呈現酒紅色（見圖2（a）），最大吸收波長為525 nm（見圖2（b））。由透射電鏡圖（見圖2（c））可以看出，納米金尺寸均勻，具有良好的單分散性，沒有發生團聚，粒徑統計（見圖2（d））顯示納米金的平均粒徑為（14.4±1.7）nm。

圖2 納米金的表征

3.2 納米金生物探針的表征

在低pH環境下，DNA能夠快速吸附到納米金表面，進而通過巰基與金的配位作用實現偶聯［14］，本實驗中與乙肝病毒核酸互補的兩段DNA序列的5′端各加入12個腺嘌呤（A）作為連接臂，目的是為了減少后續檢測時反應的空間位阻。納米金偶聯DNA后，水合粒徑增大，如圖3（a）所示，未修飾的納米金水合粒徑約為15 nm，修飾DNA后水合粒徑增至22 nm左右（探針1、2）。納米金和探針溶液中分別加入1 mol／L NaCl，納米金迅速變藍（圖3（b），①），表明納米金發生團聚，而探針1和探針2依然保持酒紅色（圖3（b），②、③），與納米金原液相比幾乎沒有明顯顏色變化（圖3（b），④），說明探針1、2在高鹽度的環境下仍然保持較好的單分散性。這是因為納米金主要是通過彼此間的靜電斥力穩定存在溶液中，當加入大量鹽時，會屏蔽納米金表面的電荷，進而發生團聚；而在納米金表面修飾上DNA后，由于DNA對納米金的穩定作用，使其在高鹽度環境中也不會團聚［17-18］。納米金探針水合粒徑的增大及穩定性的提高證明DNA被成功修飾到納米金表面。進一步通過透射電鏡和吸收光譜進行表征，如圖3（c）～（f）所示，兩種探針均保持良好的單分散性，與未修飾的納米金相比（圖2（b）、（c）），尺寸和吸收光譜都沒有明顯的變化，表明修飾過程并未造成納米金團聚，也沒有改變納米金的光學性質。

圖3 （a）納米金、探針1、2的水合粒徑；（b）納米金及探針的穩定性測試：①～③依次為納米金、探針1、2加入1 mol／L NaCl的照片，④納米金原液的照片；（c）、（d）探針1、2的透射電鏡圖；（e）、（f）探針1、2的吸收光譜圖

3.3 納米金生物探針用于乙肝病毒核酸檢測的原理及可行性驗證

檢測原理示意圖如圖4（a）所示，探針1、2遇到目標DNA片段時，會通過堿基互補配對原則進行雜交反應，從而縮短納米金顆粒間的距離進而發生團聚，納米金溶液從酒紅色變成藍紫色，這樣就實現了目標病毒核酸的可視化檢測。對該方案的可行性進行了驗證：納米金生物探針用于陽性樣品（含有0.1 μmol／L的乙肝病毒核酸）檢測時，溶液顏色變成了藍紫色，而空白樣品（不含乙肝病毒核酸）保持酒紅色（圖4（b）），相應的吸收光譜顯示空白組的吸收光譜沒有發生明顯變化，最大吸收波長依然在525 nm左右，而陽性組最大的吸收峰紅移至590 nm左右（圖4（c））；透射電鏡表征顯示空白組的探針呈現單分散狀態，而陽性組的探針出現較嚴重的聚集狀態，更直觀地展示了納米金探針與目標DNA雜交后引起的團聚反應（圖4（d）～（e））。以上實驗結果表明該檢測方案切實可行，后續采用590 nm處吸收值與525 nm處吸收值的比值（A590／525）作為檢測信號。

圖4 （a）納米金生物探針用于乙肝病毒核酸檢測原理的示意圖；（b）空白組和陽性組的照片；（c）空白組和陽性組的吸收光譜圖；（d）空白組的透射電鏡圖；（e）陽性組的透射電鏡圖；陽性樣品里含有10－7 mol／L的乙肝病毒核酸，空白樣品中加入等體積的超純水

3.4 最優檢測條件的探討

對檢測過程中的孵育溫度、反應時間、NaCl濃度進行了優化，結果如圖5所示。隨著反應溫度的升高，信噪比（陽性信號與空白信號的比值）先增大后減小，在30 °C時達到最大值（圖5（a）），這是因為升高溫度有助于提高反應速率，但溫度過高也可能會導致DNA解鏈，故選用30 °C作為最佳反應溫度；而反應時間對檢測信號影響不大（圖5（b）），說明該反應速度很快，為了保證反應充分，選擇5 min作為最佳反應時間；DNA的雜交需要一定的離子強度，如圖5（c）所示，NaCl的添加濃度為0.4 mol／L時，信噪比最大，故在檢 測體系用0.4 mol／L的NaCl保持離子強度。

圖5 檢測條件的優化（柱狀圖上方給出的是陽性組信號與空白組信號的比值，誤差線＝±標準偏差（重復3次））

3.5 檢測的特異性與重現性

將該方法用于丙肝病毒的反轉錄DNA和艾滋病毒的反轉錄DNA的檢測，結果如圖6所示，即使非目標DNA的濃度高出乙肝病毒DNA100倍時，仍不能產生明顯的信號，均與未加DNA的空白樣品相差不大，這說明該方法具有良好的特異性。進一步利用同一批次的納米金探針進行組內重復性實驗、不同批次的納米金探針進行組間重復性實驗，得組內相對標準偏差為0.51%，組間相對標準偏差為0.85%，表明該方法重現性較好（見表1）。

圖6 納米金生物探針檢測不同病毒核酸和空白樣品所得的信號值

表1 本方法的組內及組間重現性

3.6 檢測的定量范圍及檢測限

用該方法檢測不同濃度的乙肝病毒DNA，所得信號隨著目標DNA濃度的增大而增大（見圖7），在5～1 000 nmol／L范圍內具有良好的線性關系。進一步測定11組空白樣品的信號，得平均值為0.411，標準偏差為0.004 3。以空白樣品信號的平均值與其3倍標準偏差的和為可測量的最小檢測信號［19］，將最小檢測信號代入到標準曲線的方程中，算出檢測限為0.66 nmol／L。

圖7 納米金生物探針用于乙肝病毒核酸檢測的標準曲線

4 結 語

本實驗基于納米金技術構建了可以識別乙肝病毒核酸的生物探針，進而通過雜交反應，形成納米金團聚，產生顏色變化，實現了乙肝病毒核酸的簡便快速檢測。實驗涉及材料、化學、生物、醫學等多個學科的理論知識以及相關的實驗方法和技術，具有較強的綜合性和交叉性，且立足學術前沿，圍繞病毒檢測等社會熱點問題，在我校吸引了大批化學、材料等相關專業的學生開展實驗。教學效果顯示學生對實驗項目懷有極大的熱情，能夠充分發揮其自身的主觀能動性，圓滿完成課題。本實驗從文獻調研到實驗實施再到論文撰寫和答辯，基本涵蓋了科學研究的一般步驟，能夠讓學生體驗一套完整的科研訓練過程，從而極大地提高綜合實驗能力和科研素養，助力復合型人才和創新型人才的培養。