化妝品中丁丙倍他米松的定性與定量分析

郝 彬， 李 薇

（上海交通大學藥學院，上海 200240）

0 引 言

糖皮質激素（Glucocorticoids）具有抗炎、抗毒、抗過敏、抗休克、非特異性抑制免疫及退熱等多種作用，用于風濕性疾病、自身免疫病、嚴重感染或炎性反應以及過敏性疾病的治療，同時也是皮膚科臨床應用最廣泛的外用藥物之一［1］。因長期使用糖皮質激素會對人體造成嚴重危害，如引起激素依賴性皮炎、皮膚萎縮變薄及內分泌紊亂等毒副作用［2-4］，2015年版的《化妝品安全技術規范》將糖皮質激素列為化妝品禁用組分。但因糖皮質激素對皮膚具有顯著的消炎祛痘、美白護膚功效［2］，部分廠商為了謀取利益仍然非法將其加到化妝品中，因此化妝品中檢出各類激素的事件常有報道［5］。

我國自2010年開始實施國家標準《GB／T 24800.2-2009化妝品中四十一種糖皮質激素的測定》。2019年9月，國家藥品監督管理局發布通告將《化妝品中激素成分的檢測方法》和《化妝品中抗感染類藥物的檢測方法》納入化妝品安全技術規范。為規避監管，一些新的糖皮質激素不斷被合成和添加，而法定檢驗方法以及諸多化妝品中糖皮質激素檢測方面的文獻均是基于已知糖皮質激素標準品的液相-質譜聯用檢測方法［6-11］，雖然其檢測范圍不斷拓展至80多種［12，19］，但仍無法覆蓋所有的糖皮質激素衍生物，導致逃避監管的非法添加。

我們在日常檢測中發現了一種檢測標準之外的倍他米松類似物被非法添加到化妝品中，經過QTOF一級、二級質譜解析，與倍他米松的二級質譜比對和二級碎片裂解機理推斷，并結合堿水解反應的結果，確定了該物質為倍他米松丁酸丙酸酯（無市售標準物質），同時根據水解產物倍他米松的檢測確定其在化妝品中的含量。倍他米松屬于長效、強效糖皮質激素類藥物［13-14］，作用時間可持續36～54 h，是皮膚科常用的外用糖皮質激素類藥物，也是化妝品中常添加的禁用物質［15］。除了國家標準中列出的倍他米松醋酸酯、戊酸酯及雙丙酸酯，還可見丙酸酯［16-17］、雙乙酸酯［16］、雙戊酸酯［16］、硬脂酸酯［16］、苯甲酸酯［18-19］、丁酸乙酸酯［20］等諸多衍生酯。顯然在缺少標準品情況下無法應用三重四極桿質譜或高分辨質譜進行準確的定性，更不可能進行定量檢測。

本研究所建立的方法可應用于其他倍他米松衍生酯的檢測，有助于解決該類激素可能逃避監管的各種新型、未知衍生酯的檢測問題；為化妝品中非法添加糖皮質激素成分的高通量篩選和確認提供新的檢測思路，有助于質監和藥監部門對化妝品市場進行有效的監管。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

儀器：LC 30A超高壓液相色譜儀（島津）；X500R四極桿飛行時間質譜儀（Sciex）；Acquity UPLC超高壓液相色譜儀（Waters）；Qtrap 5500三重四極桿質譜儀（AB Sciex）；5430R高速冷凍離心機（Eppendorf）；混合器（Eppendorf）；超聲波發生器（上海安譜）；Milli-Q超純水處理系統（Millipore）；固相萃取裝置（CNW，上海安譜）；N-EVAP 112氮吹儀（Organomation Associates）。

試劑：甲酸（MS級，ThermoFisher）；甲醇、乙腈（HPLC級，Merk）；倍他米松、地塞米松（Macklin）；Oasis HLB固相萃取柱（60 mg／3 mL，Waters）；待測化妝品試樣（水樣溶液，來自某化妝品代工廠家送檢樣品）。

1.2 對照品溶液的配制

分別準確稱取適量倍他米松、地塞米松標準品，用甲醇分別配制成濃度為100 mg／L的標準儲備液，根據需要逐級稀釋成不同濃度的系列標準工作液。

1.3 待測樣品溶液的制備

（1）提取和固相萃取（SPE）凈化。取化妝品試樣1.0 mL于15 mL聚丙烯塑料離心管中，加入10 mL甲醇，渦旋混勻，超聲提取20 min，14 000 r／min離心10 min，收集上清液于15 mL聚丙烯塑料離心管中，于50℃水浴中氮氣吹干后，加入3 mL 30%甲醇水溶液溶解殘渣，所得溶液進行固相萃取。固相萃取柱依次用6 mL甲醇活化、6 mL水平衡后，將樣品溶液過柱，先用6 mL 30%甲醇水溶液淋洗，再用6 mL 80%甲醇水溶液洗脫。SPE洗脫液于4℃下140 00 r／min高速離心10 min，取上清液進行液質分析或進行后續的堿水解反應。

（2）樣品的堿水解。取20 μL SPE洗脫液于2 mL塑料離心管中，依次加入280 μL乙腈和0.1 mol／L NaOH溶液100 μL，渦旋10 s后置于Thermomixer中，25℃下600 r／min反應30 min，取樣100 μL加入25 μL 0.1 mol／LHCl溶液，渦旋混勻，待液質分析。

1.4 定性分析條件

（1）LC 30A色譜條件。色譜柱：Waters ACQUITY UPLC BEH C18柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm；Waters）；流動相A為水溶液，B為乙腈，流速0.4 mL／min，柱溫45℃，梯度洗脫程序：0～20 min，B相從20%線性升至65%；20～22 min，B相維持95%；22～22.1 min，B相從95%線性降至20%并保持至24 min。

（2）X500R質譜條件。離子源溫度為550℃；簾氣、輔助氣1和輔助氣2均為310.264 kPa；離子源電壓為5.5 kV；正離子IDA掃描模式；質量掃描范圍m／z 50～1 000；解簇電壓為80 V；碰撞能量為35 V；數據采集處理軟件：Sciex OS 1.6.2。

1.5 定量分析條件

（1）Acquity UPLC色譜條件。色譜柱：Waters ACQUITY UPLC BEH C18柱（50 mm×2.1 mm，1.7 μm；Waters）；流動相A為水溶液，B為乙腈，流速0.4 mL／min，柱溫45℃，梯度洗脫程序：0～2 min，B相從20%線性升至30%；3～4 min，B相從30%線性升至95%；4～5 min，B相維持95%；5～6 min，B相降至20%。

（2）Qtrap 5500質譜條件。離子源溫度：500℃；簾氣、輔助氣1和輔助氣2均為310.264 kPa；離子源電壓：5 kV；ESI＋模式下倍他米松多反應監測（MRM）條件：393.2→373.4，CE＝15；393.2→355.2，CE＝18；數據采集軟件：Analyst 1.6.3，數據處理軟件：MultiQuan 2.1.1。

2 結果與討論

2.1 化妝品中未知糖皮質激素的定性分析

待測樣品的總離子流圖（見圖1（a））中16.85 min質譜峰對應的一級質譜圖提示m／z 519.274 3（見圖1（b）），對應的分子式為C29H39FO7，并不在國標檢測的41種糖皮質激素范圍內。m／z 519.274 3的二級質譜碎片中出現m／z 393.204 2，與地塞米松、倍他米松的m／z一致，同時其他主要碎片離子，如m／z 337.178 4、319.168 3、291.173 9、279.173 7、277.158 6、263.142 4、185.096 0、171.081 2、147.080 1與地塞米松、倍他米松的碎片相同；僅有個別離子是特異性的，如m／z 115.039 0、411.215 3、87.043 2、71.047 3、57.033 4（見圖1（c），圖2）。因此可推測待測樣品中的糖皮質激素為地塞米松或倍他米松的衍生物。

圖1 待測樣品的QTOF質譜圖

圖2 待測樣品與倍他米松的二級質譜圖比較

地塞米松和倍他米松是一對同分異構體，兩者可達到色譜分離，保留時間分別為6.75和6.60 min（圖3（b））。待測樣品中的糖皮質激素經堿水解后產物保留時間為6.60 min（圖3（a）），因此確定其為倍他米松酯。根據分子式C29H39FO7檢索ChemSpider數據庫可得到2個倍他米松衍生酯：戊酸醋酸倍他米松及丁酸丙酸倍他米松。

圖3 待測樣品堿水解后提取離子流圖（a）及倍他米松、地塞米松標準品提取離子流圖（b）

進一步分析待測樣品二級質譜中的特異性碎片并總結其裂解規律（見圖4），m／z 57.033 4對應于丙酸根，m／z 71.047 3對應于丁酸根，m／z 87.043 2對應于丁酸基團，m／z 115.039 0提示丙酸的結合位點在21-OH上，因此根據四極桿-飛行時間質譜的一級和二級數據可確定待測樣品中的未知糖皮質激素為17-丁酸-21-丙酸倍他米松（丁丙倍他米松）。

圖4 未知糖皮質激素的質譜裂解規律

2.2 酯類糖皮質激素的堿水解條件優化及定量

0.4%的NaOH水溶液、1.0%的Na2CO3水溶液和1.0%的LiOH水溶液均可水解倍他米松酯生成倍他米松，0.4%NaOH在30 min內可將丁丙倍他米松水解完全（見圖5）。取系列濃度的倍他米松標準品按低濃度到高濃度連續進樣，以被測物濃度（x）為橫坐標，以相應的峰面積（y）為縱坐標計算標準曲線，y＝13 467x－4 862，R2＝0.997 9。將待測樣品SPE的甲醇洗脫液經0.4%NaOH水解30 min后測定其中的倍他米松濃度為39.2 ng／mL，根據摩爾比和稀釋倍數可計算得到未知樣品中丁丙倍他米松的含量為310 ng／mL。

圖5 丁丙倍他米松的水解時間曲線（以最大的峰面積為100%）

3 結 語

本研究首次應用堿水解和高分辨質譜鑒定了待測化妝品中非法添加的糖皮質激素-倍他米松丁酸丙酸酯，使用現有國家化妝品安全技術規范所列檢測方法無法檢出該激素。在無標準品情況下通過水解反應后對倍他米松的定量檢測，確定了待測化妝品中丁丙倍他米松的含量為310 ng／mL。本研究可對化妝品中未知無市售標準品的酯類糖皮質激素進行快速定性、定量分析，從而有效檢測藥品、食品、保健品、化妝品中的非法添加，是對現有國家標準檢測化妝品中糖皮質激素物質的有力補充。