小型綜合科研實驗培養醫學生科研能力的探索

胡 俊， 趙 熠， 楊國華， 趙 旻， 武軍駐

（武漢大學基礎醫學院，武漢 430072）

0 引 言

基礎醫學是醫學教育的理論基礎，基礎醫學實驗教學是理論知識和實踐操作的連接，是培養學生科研能力的重要途徑。《國家中長期教育改革和發展規劃綱要（2010-2020年）》要求高等院校“針對不同層次、不同類型人才培養的特點，改進專業培養方案，構建科學的課程體系和學習支持體系”。傳統的基礎醫學實驗教學體系通常以形態學、機能學、病原生物學、解剖學、分子生物學等專業進行劃分，教學過程中強調本學科實驗知識技術的應用性和獨立性，使知識體系有所割裂。近些年來，國內一些醫學院校在嘗試進行基礎醫學實驗教學改革，通過課程整合使之成為結構性好、整體協調的新型課程［1-5］，使學生能在短時間內系統掌握各基礎醫學實驗的原理和操作。實驗教學改革更重要的目的是培養學生的科研意識、科研思維和科研能力，激發學生的科研熱情和科研興趣，提高學生的綜合科研素質［6-9］。

本研究以目前在生物醫學科研領域應用廣泛的熒光蛋白報告系統和慢病毒表達系統為切入點，一方面將兩項重要實驗技術融合為一個小型綜合實驗，培養本科生開展系統科研的能力，另一方面更著重于引導本科生了解生物醫學科研前沿，培養他們對科研的興趣和熱愛，為推進學生自主開展大學生創新訓練科研項目、提前進入PI（principle investigator）學術帶頭人實驗室從事科學研究等提供扎實的實驗基礎。

1 實驗設計

綠色熒光蛋白（Green fluorescent protein，GFP）及其演變來的突變體（紅色熒光蛋白RFP、黃色熒光蛋白YFP等）因具有良好的熒光激發特性、穩定的真原核細胞表達、分子量較小易于進行基因融合表達等特性，被廣泛應用為蛋白質定位的分子標記和報告基因，是當前生物及生物醫學研究中應用最為廣泛的一類熒光標記。

在生物醫學研究中，GFP作為熒光標記被廣泛應用于細胞和動物水平的研究［10-11］。在細胞水平上，利用基因融合技術，將目的基因與熒光蛋白序列融合表達，從而開展目標基因時空表達、細胞器及功能位點活細胞定位、亞細胞水平細胞器動態變化等研究。在動物水平上，熒光蛋白主要作為熒光標記用于小動物活體熒光成像。小動物活體成像技術采用高靈敏度制冷CCD相機配合特制的成像暗箱和圖像處理軟件，可以直接監控活體動物體內的細胞活動和基因行為。利用小動物活體成像技術，可以觀測活體動物體內腫瘤的生長及轉移、感染性疾病發展過程、特定基因的表達等生物學過程［12-15］。

GFP在細胞水平的應用可通過瞬時轉染細胞或是構建穩定轉化細胞系實現，使用穩定轉化的熒光標記細胞株開展細胞水平研究比瞬時轉染更為方便，且實驗結果也更為穩定可靠。在動物水平上使用GFP作為熒光標記進行長期動態觀察，則以使用穩定轉化的熒光標記細胞系為佳。因此，穩定轉化的熒光標記細胞株在生物醫學科研中具有廣泛的應用，構建穩定轉化的熒光標記細胞株對于開展生物醫學科研具有非常重要的作用。

目前，構建穩定轉化細胞系效率最高的技術途徑是慢病毒技術［16-17］。慢病毒載體是基于人類免疫缺陷I型病毒（HIV-1）為基礎發展起來的載體系統，由包裝載體和表達載體兩部分組成。慢病毒載體系統刪除了全部HIV-1的編碼基因，在介導目標基因表達時不會表達HIV-1蛋白，其安全性已在國內外長期科研實踐中得到了充分證實。

小型綜合科研實驗的內容和技術路線如圖1所示。通過構建一個基于慢病毒系統的GFP表達載體，經慢病毒包裝和感染后篩選獲得穩定表達GFP的A549細胞系，再使用該穩轉細胞系進行裸鼠成瘤實驗，最后活體觀察裸鼠體內腫瘤的綠色熒光。

圖1 實驗技術路線

這個實驗項目融合了基因克隆、載體構建、細胞培養、瞬時轉染、病毒收集、病毒感染、裸鼠成瘤等分子生物學實驗、細胞學實驗、病毒學實驗和動物實驗，又涉及激光共聚焦顯微鏡、流式細胞儀、小動物活體成像系統等常用大型實驗設備的使用，具有很強的綜合性。這個實驗項目旨在帶領醫學本科生從實驗目的、實驗設計、實驗安排、實驗實施等多個方面了解生物醫學科研如何由淺顯到深入的開展，對醫學本科生進行系統科研啟蒙。

2 實驗材料

2.1 質粒和細胞株

真核熒光表達質粒pEGFP-C1、慢病毒表達質粒PLVX-PURO、慢病毒包裝質粒psPAX2和pMD2.G、人腎上皮細胞系HEK293T和人非小細胞肺癌細胞系A549均來自武漢大學基礎醫學院基礎醫學實驗教學中心。

2.2 主要試劑

分子克隆所用超強高保真PCR試劑盒、DNA分子量標準品D2000 DNA marker和1 kb plus ladder、DNA產物純化試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司；內切酶XmaI、XbalI和T4 DNA連接酶購自NEB。

細胞實驗所用的DMEM培養基、MEM培養基、胎牛血清、PBS、胰酶消化液購自Hyclone；脂質體核酸轉染試劑購自翌圣生物科技（上海）股份有限公司。

2.3 主要儀器

二氧化碳培養箱（德國賓得）、倒置熒光顯微鏡（奧林巴斯）、激光共聚焦顯微鏡（奧林巴斯）、流式細胞儀（貝克曼Cytoflex）、小動物活體成像儀（美國BRUKER）。

3 實驗方法和結果

3.1 慢病毒GFP熒光載體構建

慢病毒GFP熒光載體PLVX-Puro-GFP的質粒結構如圖2（a）所示。以pEGFP-C1質粒為模板，使用引物GFP-FULL-XmaI-F和GFP-FULL-XbaI-R（見表1）擴增獲得GFP片段［見圖2（b）］；使用XmaI和XbaI雙酶切PCR擴增的GFP片段和PLVX-Puro質粒，回收片段和質粒后進行連接和轉化［見圖2（c）］。從轉化平板上隨機挑選3個單菌落小搖培養過夜后，以菌液為模板，使用引物GFP-F和GFP-R（見表1）進行PCR檢測，發現3個克隆中有2個能擴增出目標條帶，為GFP陽性克隆［見圖2（d）］；將2個GFP陽性克隆提取質粒，使用XmaI和XbaI雙酶切進行酶切鑒定，電泳檢測能觀察到載體片段和GFP插入片段［見圖2（e）］，進一步確認這2個克隆為陽性克隆。測序顯示插入的GFP片段序列完全正確，陽性克隆可用于后續實驗。

圖2 慢病毒GFP表達載體PLVX-Puro-GFP的構建

表1 載體構建所用引物

3.2 慢病毒穩定轉化的A549-GFP熒光細胞系構建

（1）細胞培養。HEK293T細胞培養于含有10%FBS的DMEM完全培養基中；A549培養于含有10%FBS的MEM完全培養基中。細胞培養于37℃、5%CO2的飽和濕度培養箱中，細胞融合度達到90%時使用胰酶消化液常規消化傳代。

（2）慢病毒包裝。使用慢病毒包裝質粒psPAX2、pMD2.G和表達質粒PLVX-Puro-GFP共同轉染293T細胞，轉染48 h后熒光顯微鏡下觀察GFP綠色熒光，發現大多數293T細胞中都能觀察到綠色GFP熒光信號，說明轉染效率較好，慢病毒包裝成功［見圖3（a）］。收集培養基，0.45 μm濾器過濾后即得慢病毒毒液。

圖3 穩定轉化A549-GFP熒光細胞系的建立

（3）慢病毒感染A549細胞及藥物篩選。提前1

天將A549細胞轉入6孔板中培養，每孔加入0.5 mL

慢病毒毒液，感染24 h后更換含有嘌呤霉素的完全培養基進行藥物篩選和持續培養。傳代2次后進行檢測，激光共聚焦顯微鏡拍攝觀察發現絕大多數細胞都有GFP熒光［見圖3（b）］，流式細胞術檢測結果顯示97.5%的細胞為GPF陽性細胞［見圖3（c）］，說明篩選獲得的A549-GFP熒光細胞系純度很高，可以用于后續成瘤實驗。

3.3 A549-GFP細胞成瘤及活體熒光檢測

將A549-GFP細胞擴大培養后制成107／0.1 mL細胞懸液（PBS重懸），注射于4周齡裸鼠皮下。注射后7天左右即可觀察到皮下有腫瘤形成，培養3周后腫瘤明顯增大［見圖4（a）］。將麻醉后的成瘤裸鼠放置于小動物活體成像儀中進行檢測，在488 nm左右的激發光下，能觀察到強烈的熒光信號［見圖4（b）］。

圖4 活體檢測腫瘤熒光

4 結 語

本項目將熒光蛋白報告系統和慢病毒表達系統這兩項重要科研技術融合建立了一個小型綜合實驗，帶領醫學本科生從實驗目的、實驗設計、實驗安排、實驗實施等多個方面，真真切切了解生物醫學科研如何由淺顯到深入地開展，如何合理地設計和開展科研實驗，真切體會一個綜合實驗的完整實施歷程，培養本科生的科研素質。

本綜合實驗中既有基因克隆、載體構建等分子生物學實驗，又有細胞培養、瞬時轉染等細胞學實驗，還有慢病毒包裝、慢病毒收集、慢病毒感染等病毒學實驗，同時還設計了裸鼠成瘤及小動物活體觀察腫瘤熒光信號等動物學實驗，涉及激光共聚焦顯微鏡、流式細胞儀、小動物活體成像系統等大型儀器的操作使用，是一個融合了多種專業實驗技術和檢測手段的綜合實驗項目，既能面向醫學本科生作為系統科研的啟蒙，也能面向研究生作為科研技術培訓項目。