遺傳學(xué)實驗教學(xué)的前沿拓展
——等溫擴(kuò)增技術(shù)和微流控芯片技術(shù)的引入與思考

趙雪瑩， 李夢欣， 盧大儒， 喬守怡， 皮 妍

（復(fù)旦大學(xué) a.生物科學(xué)國家級實驗教學(xué)示范中心；b.生命科學(xué)學(xué)院，上海 200433）

0 引 言

隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的飛速發(fā)展，基因科學(xué)越來越廣泛而深入地影響了人類的生活與健康，帶來了社會對生命科學(xué)人才培養(yǎng)的全新要求。遺傳學(xué)實驗課程是生物專業(yè)本科生的必修課程之一，如何通過課程內(nèi)容的精心設(shè)計，將新技術(shù)、新方法、新思維與經(jīng)典的遺傳學(xué)實驗教學(xué)相結(jié)合，聚焦當(dāng)今社會技術(shù)熱點，通過新案例的學(xué)習(xí)拓展學(xué)生的知識面，開啟學(xué)生的創(chuàng)新思維，培養(yǎng)學(xué)生從生活中發(fā)現(xiàn)問題、分析問題、解決問題的能力和理論聯(lián)系實際的能力，值得每一名教學(xué)工作者深入思考和探究。

傳統(tǒng)的分子遺傳學(xué)實驗課程通常以經(jīng)典的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase chain reaction，PCR）實驗作為典型教學(xué)案例，傳授學(xué)生現(xiàn)代生物技術(shù)的基礎(chǔ)知識及基本原理。近年來基因技術(shù)迅猛發(fā)展，PCR技術(shù)在原有基礎(chǔ)上獲得了極大拓展和延伸。其中，等溫擴(kuò)增技術(shù)因其特異性強(qiáng)、靈敏度高、操作簡便、耗時短、場地及設(shè)備要求低等特點［1，2］，較之PCR技術(shù)在實際應(yīng)用中具有極大的優(yōu)勢。研究人員將其與經(jīng)典的微流控芯片技術(shù)相結(jié)合，開發(fā)出核酸現(xiàn)場快速檢驗方法，已廣泛應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因材料鑒定、病原微生物的快速檢測等方向，成為生物技術(shù)造福于人類生活的經(jīng)典案例［1-4］。

在近年的遺傳學(xué)實驗課程教學(xué)中，筆者選取轉(zhuǎn)基因材料鑒定這一社會熱點問題，設(shè)計以基于環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增（Loop-mediated isothermal amplification，LAMP）技術(shù)的微流控芯片核酸檢測技術(shù)快速鑒定轉(zhuǎn)基因材料實驗作為教學(xué)案例，將等溫擴(kuò)增技術(shù)和微流控芯片核酸檢測技術(shù)引入遺傳學(xué)實驗教學(xué)，作為經(jīng)典PCR技術(shù)的教學(xué)延伸，在拓展教學(xué)內(nèi)容的深度與廣度的同時，引導(dǎo)學(xué)生關(guān)注技術(shù)的前沿發(fā)展，激發(fā)學(xué)生探索科學(xué)的興趣，培育學(xué)生的創(chuàng)新能力和科研素質(zhì)。

1 技術(shù)原理

1.1 環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增技術(shù)原理

LAMP技術(shù)是一種新型的核酸擴(kuò)增方法，其基本原理在于，通過對目標(biāo)基因的6個區(qū)域設(shè)計4種特異性引物，利用Bst DNA聚合酶的鏈置換活性，在60～65℃恒溫環(huán)境中進(jìn)行循環(huán)置換合成，可在15～60 min完成109～1010倍核酸擴(kuò)增［2，5-7］。與經(jīng)典的PCR技術(shù)相比，LAMP技術(shù)具有靈敏度高、特異性高、反應(yīng)設(shè)備要求低、速度快等優(yōu)勢，如表1所示［6-7］。

表1 LAMP技術(shù)和普通PCR技術(shù)特點比較

目前，我國已發(fā)布并實施了針對出口食品中轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的出入境檢驗檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)——SN／T3767出口食品中轉(zhuǎn)基因成分環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增檢測方法（第3-30部分），規(guī)定了12個轉(zhuǎn)基因玉米品系、5個轉(zhuǎn)基因大豆品系、8個轉(zhuǎn)基因水稻品系、1個轉(zhuǎn)基因小麥品系、1個轉(zhuǎn)基因甜菜品系及1個轉(zhuǎn)基因油菜品系的檢測方法［8-11］。LAMP技術(shù)因其優(yōu)點突出，成為了目前轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品快速檢測的重點發(fā)展方向。

1.2 微流控芯片核酸檢測技術(shù)原理

微流控技術(shù)是一種在微納米級別的空間內(nèi)精確操控微尺度流體的新興技術(shù)，能夠?qū)⑸锘蚧瘜W(xué)樣品的整個反應(yīng)和分析過程的基本操作集成在一片由微結(jié)構(gòu)和微通道構(gòu)成的芯片上，通過對微流體的精確控制，實現(xiàn)樣品的自動化檢測和分析［12-13］。與傳統(tǒng)的檢測方法相比，微流控芯片體積小、操作簡便、耗樣量少、檢測成本低、設(shè)計靈活，已經(jīng)發(fā)展成為一個生物、化學(xué)、醫(yī)學(xué)、材料學(xué)、機(jī)械、電子等多學(xué)科交叉的嶄新研究領(lǐng)域［14］。

微流控芯片具有高度集成化的優(yōu)勢，能夠減少檢測反應(yīng)對實驗場地與大型儀器的依賴性，而基于LAMP的核酸檢測技術(shù)僅需簡單控溫裝置即可實現(xiàn)對目標(biāo)核酸高靈敏度的檢測。微流控芯片與LAMP技術(shù)相結(jié)合，通過開發(fā)小型便攜化的核酸檢測裝置，能夠極大地簡化操作、節(jié)約時間和樣本，且反應(yīng)靈敏、特異性強(qiáng)，在食品檢測、病原微生物檢測、轉(zhuǎn)基因檢測等方向均具有較好的應(yīng)用前景［15-16］，用于實驗課程教學(xué)案例中，既具有較強(qiáng)的可操作性，也具有很好的現(xiàn)實意義。

2 教學(xué)方案設(shè)計

轉(zhuǎn)基因大豆MON89788是由孟山都遠(yuǎn)東有限公司研發(fā)的抗除草劑草甘膦大豆品種，我國農(nóng)業(yè)部于2013年批準(zhǔn)其進(jìn)口用作加工原料。實驗中，將轉(zhuǎn)基因大豆MON89788為實驗對象，利用基于LAMP的微流控芯片核酸檢測技術(shù)對MON89788及對照的非轉(zhuǎn)基因大豆進(jìn)行檢測，建立轉(zhuǎn)基因檢測的實驗課程教學(xué)案例。通過該實驗教學(xué)，傳授學(xué)生等溫擴(kuò)增技術(shù)、微流控芯片技術(shù)及轉(zhuǎn)基因檢測技術(shù)等前沿知識，引導(dǎo)學(xué)生了解前沿科技，激發(fā)其探索科學(xué)問題的興趣。

實驗安排在遺傳學(xué)實驗課程的最后一次進(jìn)行。首先，對轉(zhuǎn)基因及非轉(zhuǎn)基因大豆粉末進(jìn)行核酸提取，獲得待測樣本的基因組DNA后，將預(yù)設(shè)好的轉(zhuǎn)基因大豆MON89788品系特異序列引物和通用的大豆內(nèi)源基因引物分別與熒光染料混合，加至微流控芯片的引物孔中，完成引物預(yù)處理；然后，配置LAMP反應(yīng)液，并加入待測樣本DNA，混合后加至微流控芯片的反應(yīng)孔中，將芯片置于等溫擴(kuò)增微流控芯片反應(yīng)儀，實時收集擴(kuò)增反應(yīng)的熒光值；最后，導(dǎo)出熒光數(shù)據(jù)，完成數(shù)據(jù)分析及實驗報告。

實驗中每位學(xué)生獨立完成1份轉(zhuǎn)基因大豆樣品的檢測；每2人為1小組，小組內(nèi)共享實驗設(shè)備及耗材，并在實驗過程中交流討論，互幫互助；每12人為一大組，使用一張微流控芯片完成檢測。每一大組完成一次非轉(zhuǎn)基因大豆檢測對照實驗及以水為檢測對象的陰性對照實驗。

本次實驗課程將等溫擴(kuò)增技術(shù)和微流控芯片技術(shù)作為一種全新的基因檢測方法引入了遺傳學(xué)實驗教學(xué)，課程內(nèi)容包括技術(shù)原理講解、實驗操作指導(dǎo)、學(xué)生獨立完成檢測實驗、數(shù)據(jù)分析與處理、問題討論與反思等環(huán)節(jié)，鼓勵學(xué)生發(fā)現(xiàn)問題，培養(yǎng)學(xué)生科學(xué)探索和科學(xué)應(yīng)用的能力，提高學(xué)生的創(chuàng)新意識。

3 教學(xué)效果

3.1 實驗結(jié)果

轉(zhuǎn)基因大豆樣本的檢測結(jié)果如圖1所示。采用大豆通用引物分別對轉(zhuǎn)基因及非轉(zhuǎn)基因大豆樣本進(jìn)行檢測，均取得了較好的擴(kuò)增結(jié)果，熒光強(qiáng)度值在反應(yīng)7.15 min左右時出現(xiàn)了指數(shù)級上升，提示其檢測結(jié)果為陽性；采用轉(zhuǎn)基因大豆特異性引物分別對轉(zhuǎn)基因及非轉(zhuǎn)基因大豆進(jìn)行檢測，轉(zhuǎn)基因大豆樣本在反應(yīng)15 min左右時即出現(xiàn)了指數(shù)級上升，獲得陽性檢測結(jié)果，而非轉(zhuǎn)基因大豆樣本未出現(xiàn)熒光信號的指數(shù)級增強(qiáng)，提示檢測結(jié)果為陰性。

圖1 微流控?zé)晒饧夹g(shù)快速鑒定轉(zhuǎn)基因大豆實驗檢測結(jié)果

3.2 問卷調(diào)查

在連續(xù)兩年課堂教學(xué)的實踐之后，通過問卷的形式，針對學(xué)生對課堂教學(xué)的滿意度及知識掌握程度、實驗開設(shè)的必要性等問題進(jìn)行了調(diào)查與評估，同時收集了學(xué)生對實驗設(shè)計和課堂教學(xué)模式的意見與建議。調(diào)查結(jié)果如圖2～3所示。

圖2 對教學(xué)效果調(diào)查結(jié)果

圖3 對實驗的學(xué)習(xí)意義調(diào)查結(jié)果

問卷調(diào)查結(jié)果顯示，針對等溫擴(kuò)增技術(shù)，41.38%的學(xué)生表示之前從未接觸過該技術(shù)，48.28%的學(xué)生反映僅接觸過一點相關(guān)知識；針對微流控技術(shù)，91.38%的學(xué)生表示之前從未接觸過相關(guān)知識。通過課堂上技術(shù)原理的講解和實際動手實驗操作，實驗教學(xué)達(dá)到了較好的效果，其中79.04%的學(xué)生對微流控技術(shù)快速鑒定轉(zhuǎn)基因材料的方法和原理有了較好的理解，而對于更深層次的LAMP技術(shù)，62.38%的學(xué)生能夠有較好的理解。對于該實驗課程的設(shè)置，82.85%的學(xué)生認(rèn)為該實驗選題新穎，能夠?qū)W習(xí)到生命科學(xué)最前沿的知識和技術(shù)，且與日常生活密切相關(guān)，應(yīng)用性很強(qiáng)，實驗的開展很有意義。學(xué)生也對該實驗課程的學(xué)習(xí)意義進(jìn)行了肯定，認(rèn)為在該實驗中能夠同時學(xué)習(xí)到微流控技術(shù)、等溫擴(kuò)增技術(shù)和轉(zhuǎn)基因材料鑒定技術(shù)，使課堂知識與實踐生活得到了很好的結(jié)合。

在課堂教學(xué)過程中，學(xué)生對該實驗表現(xiàn)出了濃厚的興趣，課堂氣氛活躍，討論熱烈，在完成實驗任務(wù)的同時，也為該實驗的課堂教學(xué)設(shè)計提出一些很好的意見和建議，如希望教師在講解過程中多增加一些對等溫擴(kuò)增技術(shù)基礎(chǔ)原理的講述，以及進(jìn)一步提高實驗參與度，并希望在等溫擴(kuò)增引物設(shè)計、微流控芯片工作原理等方面有更多的了解，學(xué)生的積極反饋也為教師后期進(jìn)一步優(yōu)化實驗設(shè)計、提高教學(xué)效果提供了很大助力。

3.3 教學(xué)成效

微流控芯片核酸檢測技術(shù)快速鑒定轉(zhuǎn)基因材料實驗課程實施兩年來，取得了較為理想的教學(xué)效果。本實驗的設(shè)計聚焦社會技術(shù)熱點，選取轉(zhuǎn)基因材料為實驗對象，吸引學(xué)生濃厚的興趣，具有較強(qiáng)的應(yīng)用性；選取等溫擴(kuò)增技術(shù)和微流控芯片技術(shù)相結(jié)合的微流控芯片核酸檢測技術(shù)為檢測方法，操作簡便，反應(yīng)迅速、有利于課堂教學(xué)的順利實施；等溫擴(kuò)增技術(shù)作為經(jīng)典的PCR擴(kuò)增技術(shù)的拓展和延伸，在實際應(yīng)用中具有特殊的優(yōu)勢，是技術(shù)創(chuàng)新的典型案例，是遺傳學(xué)教學(xué)內(nèi)容很好的補(bǔ)充，能夠幫助學(xué)生拓展思路、培育創(chuàng)新精神；微流控芯片核酸檢測技術(shù)作為生物學(xué)與化學(xué)、材料學(xué)等學(xué)科交叉融合的創(chuàng)新成果，同時也是生命科學(xué)應(yīng)用于實際生活的最前沿技術(shù)，能夠開闊學(xué)生的視野，培養(yǎng)學(xué)生從實踐中發(fā)現(xiàn)問題、解決問題的能力。課程實踐的初步結(jié)果顯示，學(xué)生對該實驗的認(rèn)可度很高，這有利于后期的進(jìn)一步實踐和推廣。

4 結(jié) 語

遺傳學(xué)是一門歷史悠遠(yuǎn)的學(xué)科，近年來的發(fā)展十分迅猛。在經(jīng)典的遺傳學(xué)實驗教學(xué)課程基礎(chǔ)上引入新技術(shù)、新方法、新案例，對于提高實驗課程的趣味性，充分調(diào)動學(xué)生學(xué)習(xí)的積極性，激發(fā)學(xué)生主動學(xué)習(xí)的熱情，具有極大的意義。在近兩年的教學(xué)實踐中嘗試引入微流控芯片核酸檢測技術(shù)快速鑒定轉(zhuǎn)基因材料實驗的案例，獲得了學(xué)生的高度認(rèn)可，取得了較好的教學(xué)效果。未來將進(jìn)一步探索新技術(shù)與經(jīng)典遺傳學(xué)實驗教學(xué)相融合的教學(xué)模式，在傳授學(xué)科基礎(chǔ)知識和基本原理的同時，幫助學(xué)生開闊視野，緊跟前沿科技的發(fā)展，提升學(xué)生的創(chuàng)新意識和科學(xué)素養(yǎng)，培育出更多適應(yīng)于當(dāng)代生物科技發(fā)展需求的創(chuàng)新型人才。