腐皮鐮刀菌對人參根部生理變化的響應機制

馮 琳， 孫 茹， 趙貴佳， 趙 雨， 連文慧

(長春中醫藥大學 人參科學研究院， 長春 130117)

人參(PanaxginsengC.A.Meyer)為五加科人參屬多年生草本植物的干燥根[1]， 是傳統的名貴中藥. 近年來， 隨著人參栽培面積的不斷增加， 人參根腐病快速蔓延[2]， 人參受根腐病病原菌侵染后會出現根部腐爛、 葉片發黃， 甚至死亡. 人參根腐病的主要病原菌為尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)和腐皮鐮刀菌(Fusariumsolani). 張晶晶[3]對人參根腐病病原菌進行了鑒定與致病力檢測， 結果表明， 腐皮鐮刀菌致病力強于尖孢鐮刀菌. 腐皮鐮刀菌侵染植株后分泌毒素， 破壞其細胞膜系統， 導致寄主植株出現抵抗反應， 主要體現在生理生化和形態兩方面. 鄭磊等[4]利用腐皮鐮刀菌病原菌侵染植株， 考察宿主植株的各種生理生化代謝反應與抗病性的關系， 結果表明， 侵染后的植物體生理生化指標發生顯著變化， 可能與植物抗性有關. 當病原菌侵染宿主后， 為適應寄主體內環境， 病原菌分泌大量細胞壁降解酶(CWDEs)， 主要包括羧甲基纖維素酶(Cx)、β-葡萄糖苷酶(βG)、 聚甲基半乳糖醛酸酶(PMG)、 多聚半乳糖醛酸酶(PG)、 果膠甲基反式消除酶(PGTE)、 多聚半乳糖醛酸反式消除酶(PMTE)等， 以降解寄主植物的細胞壁和胞間層， 從而使病原菌對寄主體侵入、 定殖以及擴展. 目前， 對人參根腐病的研究文獻報道較多[5]， 但對腐皮鐮刀菌與寄主的細胞壁降解酶和植物防御酶響應機制的研究較少. 本文采用腐皮鐮刀菌孢子懸浮液對人參進行人工侵染， 分析比較侵染后人參體內細胞壁降解酶和生理生化指標等的變化， 為研究根腐病菌的致病機理及其與寄主的響應機制提供理論參考.

1 材料和方法

1.1 材料和儀器

2～3年生人參購于吉林省撫松縣參王植保有限責任公司； 供試病原菌由吉林農業大學楊利民教授分離并鑒定為腐皮鐮刀菌； 馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基(PDA)和馬鈴薯葡萄糖肉湯(PD)購于北京奧博星生物技術有限責任公司； 丙氨酸解氨酶(PAL)、 超氧化物歧化酶(SOD)、 過氧化物(POD)、 多酚氧化酶(PPO)和過氧化氫酶(CAT)試劑盒購于北京索萊寶科技有限公司； 丙二醛(MDA)試劑盒購于南京建成生物工程研究所.

MJX智能型霉菌培養箱(寧波江南儀器廠)； PQX-450H型人工氣候箱(中儀國科(北京)科技有限公司)； THZ-C型恒溫振蕩器(江蘇太倉市實驗設備廠)； ECLIPSE TS2型顯微鏡(上海尼康儀器有限公司)； Centrifuge 5804 R型離心機(德國Eppendorf公司)； infinite M200 PRO型酶標儀(瑞士TECAN公司).

1.2 方 法

1.2.1 人參根腐病菌的活化和培養

用PDA培養基培養腐皮鐮刀菌， 在霉菌培養箱(25 ℃)中培養3～5 d后， 用打孔器打取5個直徑為5 mm 的菌片， 置于100 mL PD培養液中， 在恒溫振蕩器中(150 r/min， 25 ℃)震蕩3～5 d后， 先用8層紗布濾除菌絲， 在顯微鏡下用血球計數板觀察孢子數量， 再用無菌水稀釋， 最終制成濃度為4×106cfu/mL 的腐皮鐮刀菌病原菌孢子懸液(cfu為菌落數)， 置于4 ℃冰箱中備用[6].

1.2.2 人參根部病原菌侵染

先將2～3年生健康鮮人參根用清水洗凈， 再用體積分數為75%的酒精浸泡10～15 s 后， 用無菌水沖洗3次， 備用. 用滅菌后的接種針在各人參根部相同部位進行梅花狀刺傷， 且每個刺傷間隔約1 cm， 每根刺傷5處. 菌侵組在菌液中浸泡1 h， 對照(CK)組在無菌水中浸泡1 h[7]， 移植到花盆土壤中栽培， 置于人工氣候箱(溫度： (22±1)℃， 濕度： 49%～51%)中培養. 整根取樣， 取樣時間為0，7，14，21，28 d， 重復3次. 所取樣品用液氮速凍后， 于-80 ℃冰箱凍存.

1.2.3 根腐病菌侵染人參活體內細胞壁降解酶提取

分別在0,7,14,21,28 d 時， 取健康人參組織和發病人參組織各4 g 置于研缽中， 用液氮研磨至粉末狀， 加入20 mL 0.25 mol/L NaCl提取液(含1.0 mol/L Tris-HCl緩沖液， pH=8.0)， 在冰浴中研磨成勻漿， 隨后轉入離心管中， 離心15 min(4 ℃， 10 000 r/min)， 取上清液即為粗酶液， 備用.

1.2.4 細胞壁降解酶活力測定

Cx，βG，PG和PMG活性測定： 取50 ℃水浴5 min 的檸檬酸緩沖液(0.05 mol/L， pH=4.5)0.5 mL 和質量分數為1%的底物溶液(Cx的底物是羧甲基纖維素鈉，βG的底物是水楊苷， PG的底物是多聚半乳糖醛酸， PMG的底物是果膠)0.5 mL 置于試管中， 再加入0.5 mL 粗酶液， 于50 ℃酶解30～60 min， 加入DNS試劑1 mL， 在沸水中反應5 min后， 冷卻至室溫， 定容至6 mL， 在540 nm波長下測定吸光值(OD).

PGTE和PMTE活性測定： 取0.5 mL 酶液加入0.5 mL 甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液(0.05 mol/L， pH=9.0)和0.5 mL 底物溶液(PGTE的底物是多聚半乳糖醛酸， PMTE的底物是果膠)， 再加入0.5 mL CaCl2(3 mmol/L)， 在30 ℃水浴中反應10 min后， 定容至5 mL， 在232 nm波長下測定吸光值(OD).

1.2.5 根腐病菌侵染人參活體內植物防御酶及可溶性糖的提取和活力測定

PAL,SOD,POD,PPO,CAT,MDA提取與活力測定參照試劑盒說明進行， 可溶性糖的質量分數采用硫代巴比妥酸(Thiobarbituric acid， TBA)法測定[8].

1.2.6 數據分析

用SPSS 19.0軟件進行數據統計分析， 并通過單因素方差分析對相關性指標進行顯著性檢驗， 當p<0.05時， 具有顯著性意義， 用GraphPad Prism 5軟件繪圖.

2 結果與分析

2.1 腐皮鐮刀菌形態觀察

腐皮鐮刀菌菌落形態如圖1所示. 將腐皮鐮刀菌置于PDA培養基上培養5～7 d后， 觀察到白色稀疏的菌絲體， 在顯微鏡下觀察到大、 小型分生孢子， 大型分生孢子較長, 呈鐮刀形， 長度約為8～18 μm， 小型分生孢子呈卵圓形或腎型.

圖1 腐皮鐮刀菌菌落形態及顯微鏡下形態Fig.1 Colony morphology and microscopic morphology of F.solani

2.2 腐皮鐮刀菌侵染人參表觀變化

人參接種無菌水和腐皮鐮刀菌后的表觀變化如圖2所示. 由圖2可見： 接種無菌水處理后的人參接種部位變化無明顯差別； 接種腐皮鐮刀菌后的人參接種部位顏色明顯加深出現病斑， 病斑顏色呈深褐色， 并隨著時間延長發病程度逐漸加重.

圖2 人參接種無菌水和腐皮鐮刀菌后的表觀變化Fig.2 Apparent changes of P.ginseng after inoculation with sterile water and F.solani

2.3 腐皮鐮刀菌侵染人參體內CWDEs活性變化

人參接種腐皮鐮刀菌后CWDEs活性的變化如圖3所示. 由圖3可見： 菌侵組中兩種纖維素酶Cx和βG活性峰值出現較早， 呈先上升后下降再趨于穩定的趨勢， Cx在第7天時達到峰值， 隨后急劇下降， 14 d 后趨于穩定，βG在第7天時達到峰值后下降； 對照(CK)組Cx前期無明顯變化， 21 d 后略上升，βG無明顯變化. 檢測PG，PMG，PMTE和PGTE 4種果膠酶的活性， 結果表明， PG的活性明顯高于其他幾種酶， 菌侵組的PG活性在前14 d 無明顯變化， 21 d 時達到酶活性峰值1.191 U/mg 后急劇下降(其中U定義為在室溫下， 每分鐘1 mL酶液催化底物釋放1 μmol糖或酸類物質所需的酶量)， 對照組在0.8 U/mg 上下波動較小. 菌侵組PMG活性呈上下波動的趨勢， 在第7天時達到0.262 U/mg 后略下降， 在第21天時達到0.314 U/mg， 隨后急劇下降， 對照組無明顯變化. 菌侵組PGTE和PMTE呈先升高后下降的趨勢， 在第7天達到酶活性峰值， 對照組無明顯變化. 綜上可見， 兩種纖維素酶Cx和βG活性峰值出現較早， 起主要作用的果膠酶是PG和PMG， 其中PG酶活性最高， 其次是Cx，PMG和βG， 菌侵組酶活性基本均高于空白對照組.

圖3 人參接種腐皮鐮刀菌后CWDEs活性的變化Fig.3 Changes of CWDEs activities of P.ginseng after inoculation with F.solani

2.4 腐皮鐮刀菌侵染人參植物防御酶活性變化

2.4.1 SOD,POD和CAT的活性變化

SOD,POD和CAT的活性變化如圖4所示. 由圖4可見： 人參接種腐皮鐮刀菌后， SOD活性隨時間延長呈先上升后下降的趨勢， 在14 d時， 酶活性達到高峰， 與對照組相比酶活性提高了20.34%， 隨后出現顯著性下落狀態(p<0.05)； 對照組無較大波動趨勢， 在21 d 前菌侵組的SOD活性始終高于對照組的活性水平. 人參接種腐皮鐮刀菌后， 菌侵組POD活性呈先上升后下降再上升的趨勢， 在接種腐皮鐮刀菌后第28天時， 與接種第21天相比POD活性呈顯著上升趨勢(p<0.05)， 與對照組相比提高了65.13%； 對照組在7 d 時達到高峰隨后下降趨于穩定， 前期對照組POD活性高于菌侵組， 后期菌侵組高于空白對照組. 經腐皮鐮刀菌處理后， 菌侵組與對照組CAT活性變化波動較大； 菌侵組在0～7 d時活性略下降， 隨后急劇上升， 14 d 時達到活性峰值197.890 U/g后呈下降趨勢； 對照組前21 d活性變化波動較小， 第21天后CAT活性顯著下降(p<0.05)， 至119.947 U/g.

圖4 人參接種腐皮鐮刀菌后SOD,POD和CAT的活性變化Fig.4 Change of SOD,POD and CAT activities of P.ginseng after inoculation with F.solani

2.4.2 PAL和PPO的活性變化

PAL和PPO的活性變化如圖5所示. 由圖5可見： 經腐皮鐮刀菌侵染后， 菌侵組PAL活性呈先增加后穩定的趨勢， 在第14天時達到活性峰值； 對照組呈下降趨勢， 并且菌侵組始終高于對照組活性， 7，14，21 d分別比對照組增加12.51%，37.54%，18.75%； 菌侵組的PAL活性整體高于對照組的活性水平. 對照組PPO活性略有增加； 接種腐皮鐮刀菌的人參PPO活性在0～7 d 時急劇上升， 達到峰值34.456 U/g， 隨后急劇下降， 14 d后趨于穩定并低于空白對照組活性.

圖5 人參接種腐皮鐮刀菌后PAL和PPO的活性變化Fig.5 Change of PAL and PPO activities of P.ginsengafter inoculation with F.solani

2.4.3 可溶性糖的質量分數和MDA質量摩爾濃度的變化

可溶性糖的質量分數和MDA質量摩爾濃度的變化分別如圖6和圖7所示. 由圖6可見， 菌侵組與對照組的可溶性糖質量分數呈逐漸下降趨勢， 并且菌侵組始終高于對照組的質量分數. 由圖7可見， 菌侵組和對照組MDA的質量摩爾濃度呈先升高后下降趨勢， 在21 d時達到峰值， 并且菌侵組MDA低于對照組MDA的質量摩爾濃度.

圖6 人參接種腐皮鐮刀菌后可溶性糖質量分數的變化Fig.6 Changes of mass fraction of soluble sugar of P.ginseng after inoculation with F.solani

圖7 人參接種腐皮鐮刀菌后MDA質量摩爾濃度的變化Fig.7 Changes of mass molar concentration of MDA ofP.ginseng after inoculation with F.solani

3 結 論

病原菌入侵植物后， 初期會遇到細胞壁屏障， 在病原菌與植物識別的過程中， 病原菌釋放細胞壁降解酶， 從而有利于其入侵[9-10]: 李寶聚等[11]研究黃瓜黑星病菌致病時發現細胞壁降解酶是主要的致病因素之一; 李喜玲[12]研究灰葡萄孢菌株的致病力與纖維素酶活力呈正相關， 灰霉菌果膠酶活力高低與致病力強弱也有一定的相關性. 上述研究結果, 表明纖維素酶和果膠酶是病原菌的兩種重要致病因子. 本文研究了在腐皮鐮刀菌侵染人參過程中， 人參根部組織細胞壁降解酶的變化趨勢， 結果表明， 菌侵組PG活性最高， Cx和βG次之， PGTE和PMTE活性極低. 腐皮鐮刀菌侵染人參時， 起主要作用的果膠酶是PG和PMG， 且活性峰值出現時間較纖維素酶Cx和βG晚. 果膠酶PG活性高于纖維素酶， 這可能是由于病原菌侵染寄主后先降解纖維素中的基質多糖和纖維二糖使其轉化為葡萄糖， 隨后降解細胞壁中的果膠所致. 并且大部分菌侵組細胞壁降解酶活性高于對照組， 進一步說明纖維素酶和果膠酶在腐皮鐮刀菌侵染人參的致病過程中具有重要作用， 是主要的致病因子.

植物在酶催化下發生一系列生理生化代謝過程使植物產生防衛反應， 與植物的抗病性密切相關， 植物防御酶可作為檢測植物抗病性的重要指標[13-15]. 抗氧化酶如POD，CAT和PPO被歸為防御酶， 通常在活性氧代謝中發揮重要作用. 植物感染病原菌后， 體內活性氧的產生與消除代謝平衡被破壞， 導致代謝紊亂， SOD，POD和CAT活性增加表明清除自由基的能力增強， 可維持細胞正常代謝[16-18]. 李新等[19]研究了黃瓜感染枯萎病后的酶活性變化， 結果表明， POD,SOD,PPO和PAL可促進植物體產生多種次生代謝物質， 阻止病原菌的侵入和繁殖， 其活性與對照組相比均有不同程度的升高. 侯茜等[20]對西瓜枯萎病抗性關系的研究表明， POD和CAT活性與植物的抗病性呈正相關. 本文研究表明：

1) 菌侵組的SOD活性隨時間的延長呈先升高后下降趨勢， 菌侵組POD活性在28 d 時達到峰值， CAT活性在14 d 時達到峰值. 腐皮鐮刀菌侵染人參后， 人參為抵御菌的侵染而做出應激反應， 增加了植物防御酶活性， 增強人參對根腐病的防御能力.

2) PAL和PPO作為苯丙烷代謝途徑的限速酶和關鍵酶， 能夠調控植物抗病相關的木質素和酚類物質的氧化和合成， 參與植物體內多種防衛反應[20]. 菌侵組PAL在14 d 達到峰值后呈穩定趨勢， PPO活性在7 d 時出現峰值， 并且菌侵組酶活性高于對照組， 表明病原菌的入侵可能會誘導PPO和PAL活性水平升高， 人參防御機制被激活.

3) MDA是細胞膜的脂質過氧化作用的產物， 當植物感染病原菌后， 會抑制細胞膜內的膜脂過氧化反應[21-22]， 從而使MDA含量減少， 抗病性增強. 腐皮鐮刀菌侵染人參后， 菌侵組MDA含量低于對照組. MDA含量減少， 抑制病原菌入侵， 使抗病性增強， 并延遲其積累， 這與趙秀娟等[23]研究酶活性、 MDA含量變化與苦瓜抗枯萎病性呈負相關相符.

4) 病原菌的侵染和擴展導致營養物質輸導紊亂， 可能會引起可溶性糖含量變化， 菌侵組始終高于對照組的可溶性糖含量， 可能是機體呼吸作用增強， 促進了淀粉和纖維素等降解為可溶性糖所致， 是人參的一種自身保護性反應.

綜上， 本文研究了腐皮鐮刀菌侵染人參后， 人參根部細胞壁降解酶、 植物防御酶活性以及可溶性糖、 MDA含量變化趨勢. 結果表明， 它們均與人參抗根腐病密切相關， 為腐皮鐮刀菌病侵染人參機制的研究提供了理論依據.