偏頭痛相關外泌體miRNAs表達譜研究現狀*

何振曦，高 山，倪夕秀，劉 路，郭 莎，王亞楠，孫銘聲，趙 凌（成都中醫藥大學針灸推拿學院，四川成都 610075）

偏頭痛是最常見的原發性頭痛之一，其影響了全世界大約15%的人口，男性的患病率大約為6%～8%，女性為15%～25%[1]。與此同時，我國偏頭痛的年患病率為9.3%[1]。偏頭痛不僅給患者帶來嚴重的身心傷害，而且給患者家庭帶來沉重的經濟負擔。對疾病負擔的研究表明，我國偏頭痛每年花費約3，317 億元人民幣[3]。偏頭痛由于其沉重的經濟和社會負擔被世界衛生組織列為第六名的有重大疾病負擔的疾病[4]。盡管偏頭痛的致殘程度、直接和間接醫療費用、對日常的生活和工作干擾及社會負擔等方面影響嚴重，但仍有許多患者未得到正確的診斷和及時、恰當的治療[5]。目前，偏頭痛的診斷是基于國際頭痛學會（國際頭痛疾病分類第三版[ⅠCHD-3]）的頭痛分類[6]，主要依靠臨床癥狀進行診斷，包括持續4-72 h 的頭痛發作，同時伴有感覺和運動障礙[7]；已有研究發現多種生物標志物成為偏頭痛治療的潛在靶點，如降鈣素基因相關肽、5-羥色胺1F、谷氨酸、垂體腺苷酸環化酶、食欲素等，但此類研究只是處于初始階段，從他們的檢測到實際臨床應用還需要長時間的驗證。與此同時，陸續有研究發現外泌體miRNAs（microRNAs,miRs）有潛力作為偏頭痛生物學標志物，其高靈敏度、穩定性、特異性、高效運送性及易得性的特性恰好是外泌體miRNAs 對偏頭痛進行精準診斷的優勢所在[8-9]。此外，偏頭痛與心血管疾病風險也有關聯，偏頭痛患者患缺血性腦卒中的風險增加了2 倍。雖然心血管事件高風險的大多數結果與先兆偏頭痛有關，但最近的研究表明無先兆偏頭痛患者（migraine without aura,MWA）的心血管事件風險也會增加[10-12]。在偏頭痛和缺血性腦卒中患者中已經報道了能夠調節免疫和神經元過程的miRNAs，與這些疾病相關的明確miRNAs 可以作為臨床和（或）藥物干預的新分子指標[13]。因此，有必要進一步探索這一領域，更多地了解這些生物標志物可以揭示心血管疾病、缺血性腦梗死患者偏頭痛的共同病理生理機制。此舉對偏頭痛相關心血管疾病、缺血性腦梗死的防治具有重要意義。

1 miRNAs概述

miRNAs 是非編碼RNA 的一種，為表觀調節的一類重要分子，在體內參與細胞増殖、分化、調亡等生理調節，越來越多的證據表明，miRNAs 在疾病的發生發展過程中具有重要作用。miRNAs 被認為通過在3'UTR 位點與mRNAs結合來抑制翻譯過程，也有一些文章認為miRNAs 結合到基因的啟動子區域可以激活或抑制轉錄[14]。血液循環中的miRNAs 與蛋白-脂蛋白載體結合，相對穩定，耐髙溫、反復凍融，不易降解[15-16]。miRNAs可以以外泌體的方式釋放入血，到達遠隔組織部位，與受體細胞膜融合，進入靶細胞內，以類激素的形式發揮調節作用，完成細胞間的“通訊聯絡”[17]。由于外泌體是通過選擇性的方式分泌到細胞外空間的，因此外泌體miRNAs 被認為是比血清miRNAs 更為敏感和特異性的生物學標記物。miRNAs 不僅在人類生理學中發揮關鍵作用，而且在諸如感染性和免疫性非感染性疾病、癌癥、代謝和心血管疾病等病理過程中發揮了關鍵作用[18]。

2 研究現狀

2.1 偏頭痛潛在的miRNAs生物標記物

雖然關于偏頭痛中miRNAs 異常表達的研究很少（見表1），但仍需總結目前的研究結果和不足，為今后的相關研究提供參考。Andersen等人[19]開展了一項研究以評估偏頭痛發作期間是否發生血清miRNAs 改變，以及偏頭痛是否表現為慢性血清miRNAs 異常。此研究包括24 名偏頭痛患者和年齡、性別匹配的健康對照組。偏頭痛發作期樣本是在疼痛發作后2 小時內采集的，而疼痛緩解期樣本則是在至少連續5 天沒有偏頭痛癥狀或疼痛后的某1天采集的。在372個被評估的miRNAs 中，32 個miRNAs 被發現有差異表達，進一步的檢測發現偏頭痛發作與miR-34a-5p 和miR-382-5p 表達的急性上調有關。值得注意的是，miR-382-5p 不僅在發作期間表現出上調，而且在比較疼痛緩解期偏頭痛患者和健康對照組時其表達也上調，也被證明是偏頭痛的生物標志物（P≤0.01）。因此，作者認為miRNAs可能在偏頭痛的病理過程中起重要作用。在另一項研究中[20]，研究人員發現偏頭痛陽性家族史亞組血淸miR-188-5p表達量較陰性家族史亞組下降4.2倍，發作期miR-188-5p相對表達量較非發作期下降5.54倍，有明顯變化趨勢，但未見到顯著統計學差異。作者認為血清miR-188-5p水平在偏頭痛陽性家族史患者和偏頭痛發作期表達有下降趨勢，可能與偏頭痛陽性家族史和偏頭痛發作有關。該研究沒有得出陽性結果的原因可能是樣本量過小。遺憾的是，在上述兩項研究中，沒有嘗試區分偏頭痛類型。潘建青等[21]提取血小板miRNAs 后通過BGⅠSEW-500 sequencing 技術進行測序。總共篩選到821 個差異表達的miRNAs，這些差異表達miRNAs的靶基因主要涉及到：軸突發育等細胞組成；突觸前等神經元相關的生物學過程；細胞黏附分子結合等分子功能。作者認為與健康組相比，MWA 患者血小板miRNAs 表達模式發生明顯改變，這些miRNAs 主要參與軸突發育以及一些細胞信號傳導途徑。但遺憾的是該研究結果只是作為一個初步篩查，并沒有發現參與軸突發育以及一些細胞信號傳導的特異性表達的miRNAs。還有一項最近的研究[22]對MWA 女性患者與健康對照組的循環miRNAs 表達進行了評估。研究發現，與對照組相比，偏頭痛患者有4 種miRNAs 的表達差異具有統計學意義：miR-27b 表達上調，而miR-181a、let-7b 和miR-22 表達下調。值得注意的是，在我們的人群中，microRNA 的敏感性和特異性與臨床標準的“金標準”具有高度可比性，這表明對這4種miRNAs的綜合評估可能成為識別MWA的有效方法。未來還需要對更大的獨立人群樣本量進行前瞻性研究來驗證目前的數據。

表1 偏頭痛患者特異表達的miRNAs

表1 （續）

miRNAs 廣泛參與腦細胞凋亡、神經炎癥、氧化應激、血腦屏障完整性、神經血管生成以及中樞神經系統的其他病理生理過程[23]。有研究[24]發現miR-449a-5p 可通過靶向作用于軟件預測出的其在大鼠CALCA 3’-UTR 區的識別序列調節該基因的表達；miR-449a-5p-inhibition 可增加PC-12 細胞內CGRP蛋白的表達量。miR-449a-5p 可通過靶向識別于軟件預測出的其在CALCA的3′-UTR 區的結合序列而起到直接調節CALCA 基因表達的作用。據此我們推測，miR-449a-5p 有可能也參與了人類CALCA 基因的表達調控。

2.2 合并缺血性腦卒中、心血管疾病的偏頭痛患者miRNAs特征

偏頭痛與心血管風險之間的關系是復雜的，可能涉及多種因素，但其中一個可能的病理生理聯系在于內皮功能障礙（endothelium dysfunction,ED）。ED 是指內皮細胞功能失調，包括血管張力控制不良及增殖、遷移和形態形成能力異常[25]。ED 與偏頭痛密切相關[26-27]，同時也代表了動脈粥樣硬化病變發展的第一階段。miRNAs 參與動脈粥樣硬化生物學過程的各個階段，從ED 到細胞粘附、斑塊形成和斑塊破裂[28]。偏頭痛相關的miRNAs 與動脈粥樣硬化事件相關的miRNAs 之間存在功能重疊，進一步說明了血管事件在偏頭痛發病機制中的作用[29]。研究[22]表明，與健康對照組相比，偏頭痛患者存在miR-27b 顯著上調，而miR-181a、let-7b 和miR-22 顯著下調等差異。值得注意的是，已知同樣的miRNAs 在人類動脈粥樣硬化和腦卒中中被調節。let-7a 和let-7b 被證明對氧化低密度脂蛋白誘導的內皮細胞損傷具有保護作用[30]，這表明Let-7a和let-7b對動脈粥樣硬化等心血管疾病（cardiovascular disease,CⅤD）相關的內皮功能障礙具有保護作用。與此同時，對MWA 的研究顯示let-7b 下調，這表明let-7b 下調可能是CⅤD 和偏頭痛病理生理學中常見的內皮功能障礙風險增加的特定指標。此外，上述研究中發現的其它在MWA 中發生改變的miRNAs 也被發現與血管功能和CⅤD 事件相關，但其不是特異性地與ED 相關。MiR-27b 在外周動脈疾病患者中過表達，其水平與疾病的嚴重程度[30]相關。目前研究已經發現miR-181a 和let-7b 在年輕缺血性卒中患者血漿中被調節，這表明它們參與到了腦血管疾病[31]。此外，miR-181a 的降低與代謝綜合征患者的心血管疾病獨立相關，并且涉及血管生物學、炎癥反應和動脈粥樣硬化的幾個關鍵基因（NO-synthase 和toll 樣受體等）是其假定的靶點[32]。ER-alpha 突變與偏頭痛和心血管疾病都相關的事實表明，缺血性腦卒中、心血管疾病和偏頭痛之間存在功能聯系[33-34]。特異性miRNAs 正在成為偏頭痛、缺血性腦卒中和心血管疾病預防的新分子靶點。此外，誘發miRNAs 表達模式和個體間變異可能有助于生物標物記研究，以便直接了解這三種疾病的生物學情況，并識別缺血性腦卒中風險最高的偏頭痛人群。于此同時，偏頭痛預防、內皮修復、抗炎治療、血小板抑制或這些策略的結合是否可以預防缺血性腦卒中是未來研究的方向。對這一領域進行進一步的探索是必要的，因為對這些生物標記的進一步了解可以揭示缺血性腦卒中、心血管疾病患者偏頭痛的病理生理學機制。

3 miRNAs與偏頭痛的治療

表觀遺傳學強調通過影響基因修飾、蛋白質與DNA 和其他分子的相互作用來控制基因組中DNA和RNA 序列以外的基因表達的信息。這些變化是可逆的，這使它們成為治療設計的理想靶點[23]，而miRNAs 正是表觀遺傳學的重要組成部分。特異性miRNAs 不僅可能成為預防和緩解偏頭痛的新的藥物分子靶點，而且有希望用于偏頭痛疾病診斷、評價治療效果和監測藥物反應。目前尚未發現直接通過外泌體miRNAs 防治偏頭痛的研究結果，但通過外泌體給藥的方法為我們提供了治療偏頭痛的新思路。實驗[35]表明，通過鼻腔給藥的外泌體可有效降低偏頭痛模型大鼠對皮質擴散抑制的敏感性，但具體機制尚不清楚。Haney 等[36]將過氧化氫酶加載到外泌體中而不顯著改變其結構，結果發現該制劑有效地積聚在大腦的神經元和小膠質細胞中，產生了有效的神經保護作用。Zhuang 的研究結果[37]表明，鼻內給藥的外泌體通過提高藥物的生物穩定性并使其繞過或穿透血腦屏障，成為了非常有潛力的運載工具。

特異性miRNAs 不僅可能成為預防和緩解偏頭痛的新的藥物分子靶點，也很有希望運用于偏頭痛疾病診斷、療效監測中。Gallelli L 等人[38]發現與健康受試者相比，未經治療的MWA 患者唾液中檢測到hsa-miR-34a-5p 和hsa-miR-375（hsa-miR-34a-5p：P＜0.05；hsa-miR-375：P＜0.01）。此外，與未治療的MWA 受試者相比，治療后的MWA 受試者唾液和血液中的hsa-miR-34a-5p 和hsa-miR-375 顯著降低。這個結果在另一項平行對照研究中也得到證實[15]，在這項研究中，24例偏頭痛患者被納入兩組，分別為治療組和空白對照組。治療組中MWA 患者接受藥物治療（鎂或非甾體抗炎藥）；而空白對照組中MWA的受試者未接受任何治療。結果發現，與MWA 未接受治療的受試者相比，MWA接受治療的受試者唾液和血液中hsa-miR-34a-5p 和hsa-miR-375 顯著下降。這些發現表明，hsa-miR-34a-5p 和hsa-miR-375可能是MWA 患者有用的疾病診斷和藥物療效生物學標志物。此外，一項體外研究[39]表明一些特定的miRNAs 也可能是相關的藥物反應指標。因此，miRNAs 譜在監測偏頭痛患者藥物反應方面有潛在應用價值[40]。迄今為止，關于miRNAs 在非甾體抗炎藥治療中的作用的數據還很少發表，值得注意的是，在一個炎癥性疼痛動物實驗模型中，Qureshi 等人[41]證明塞來昔布能夠逆轉mmu-miR-211、mmumiR-411 和mmu-miR-342-5p 的下調；塞來昔布還能夠上調mmu-miR-1904、mmu-miR-1969、mmu-miR-196a、mmu-miR-337-5p 和mmu-miR-590-5p 的表達。此外，我們很可能運用特異性miRNAs 監測患者對不同治療方案的療效，從而為他們定制個體化治療，實現醫療資源的高效利用。

特異性miRNAs 還有機會在監測藥物反應中發揮作用。在偏頭痛患者的藥物治療過程中，藥物不良反應（adverse drug reactions，ADRs）的發生非常普遍，其發生與劑量誤差和藥物相互作用有關[42-45]。在這種情況下，miRNAs 監測可用于確定這些患者的給藥劑量和給藥時間，以降低發生ADRs 或藥物無效的可能性。

在中醫藥領域，由于研究結果的異質性，我們很難系統評價傳統中藥治療治療偏頭痛的安全性和有效性，但miRNAs 有機會成為其療效和副作用的監測指標。針刺作為一種副作用少且有效的非藥物治療方法，在預防偏頭痛發作、提高患者生存質量方面表現出了極大的優勢。在很多國家，針灸被廣泛應用于偏頭痛的治療；國內系統評價針刺治療無先兆偏頭痛臨床研究后發現，相對于西藥，針刺的不良反應更小[46]。目前研究發現，針刺預處理可以通過調節神經遞質及血管活性物質的合成與釋放，抑制神經源性炎性反應的發生及三叉神經系統的激活，調節腦血流量，改善腦血管功能及丘腦神經元代謝等機制來起到防治偏頭痛的作用[47]。然而，針灸防治偏頭痛的機制尚未完全闡明。miRNAs 的表達和水平可能成為評價針刺治療偏頭痛臨床療效的重要基礎參數，甚至可能成為解釋針刺治療偏頭痛機制的關鍵環節。

4 結論及展望

盡管在該領域已經有了一些相關研究，但很多結果是相互孤立的。因此，到目前為止，還沒有普遍認可的偏頭痛血清生物標志物。基于此，我們總結了目前研究存在的問題：一是影響miRNAs 表達的相關混雜因素常常被忽略。這些混雜因素可能包括：①血液采集的具體時間；②患者的年齡和性別；③合并其它疾病，如纖維肌痛[48]，這也增加了重復實驗的難度。二是miRNAs 生物學功能的鑒定困難。由于種子區識別序列較短，一個miRNA 可能結合多個靶基因，與此同時，一個基因也可能被多個miRNAs 作為靶標，這種復雜的調節網絡，給miRNAs 生物學功能的鑒別帶來一定困難。三是在研究設計和志愿者招募過程中，研究者沒有區分偏頭痛的不同類型。因為不同類型的偏頭痛頭痛可能具有不同的發病機理，所以它們的miRNAs表達也可能不同。

偏頭痛是一種具有重大疾病負擔的疾病，由于目前尚不清楚偏頭痛的完整病因、發病機制以及缺乏足夠有效的對癥治療，因此該領域的研究勢在必行。在這個問題上，miRNAs 是近年來的研究熱點。雖然外泌體miRNAs 與偏頭痛的相關性研究仍然很少，但仍然可以推斷：miRNAs 是潛在的偏頭痛的發作，發展和預后的生物學標志物，也極有可能成為未來治療的靶點和療效監測的重要指標，有希望從根本上改變偏頭痛的管理。因此，有必要繼續在該領域進行深入研究，確定最有潛力的miRNAs，從而發現其在偏頭痛的病因、發病機制、診斷、分類、靶向治療、對不同治療方式的反應以及預后的特異性表達以及表達水平的差異。