柴胡皂苷d對大鼠肝星狀細胞TGFβ-Smad信號通路mRNA表達的影響*

陳懿榕，闕任燁，劉進鍇，林柳兵，李勇△

1 上海中醫藥大學附屬市中醫醫院，上海 200071；2 上海中醫藥大學附屬上海市中西醫結合醫院；3 第二軍醫大學附屬東方肝膽外科醫院

肝纖維化是一種在持續性的肝損傷下，發生組織修復反應的動態過程，是由于細胞外基質（extracellular matrix，ECM）的合成、降解及沉積不平衡引起的病理變化，包含了復雜的細胞和分子機制［1］。防止肝硬化發生和改善肝臟疾病預后的關鍵在于阻止和逆轉肝纖維化［2］。TGFβ-Smad信號傳導通路是肝纖維化主要的信息傳導途徑［3-4］。柴胡皂苷d（saikosaponins-d，SSd）是中藥柴胡的有效藥理成分，是一種植物雌激素，可以抑制肝星狀細胞的增殖，減少細胞周期的作用。本研究擬從分子水平觀察柴胡皂苷對大鼠肝纖維化細胞HSC-T6中TGFβ-Smad表達的影響，以探求其對肝纖維化治療作用的分子機制，現報道如下：

1 材料與方法

1.1 細胞株大鼠肝星狀細胞系HSC-T6為第二軍醫大學長征醫院消化科惠贈，上海中醫藥大學附屬市中醫醫院實驗室傳代保存。

1.2 藥物及試劑SSd（中國藥品生物制品檢定所，批號：110778-201409）；雌二醇（Sigma公司，批號：D0005215）；雌激素受體完全拮抗劑ICI182.780（TOCRIS公司，批號：S119108）；雌激素受體α特異性拮抗劑MPP、雌激素受體β特異性拮抗（R，R）-THC（TOCRIS公司產品，批號：4C/144820、5A/138659）。ECL化學發光試劑盒（biosharp，批號：96030020）；牛血清白蛋白（BSA，美國Amresco公司，批號：21G1956242）；蛋白質分子量預染Marker（Pierce公司，批號：00807539）；山羊抗兔HRP標 記 二 抗（Cell Signaling公 司，批 號：AB2099233）；奶粉（上海光明公司，批號：080104）；Trizol抽 提 試劑盒（Invitrogen公司，批號：1382737）；ReverTra Ace-α-?Reverse Transcription Kit（Toyobo公司，批號：432300）；SYBR?Green Realtime PCR Master Mix（Toyobo公司，批號：656500）；DMEM高糖培養基（Thermo Scientific公司，批號：2186802）；胎牛血清（FBS，奧地利PAA公司，批號：A15108-1479）。

1.3 實驗儀器V-5060型二氧化碳細胞培養箱（德國Heraeus公司）；BH-2型光學顯微鏡（日本Olympus公司）；22R型低溫高速離心機（德國Heraeus公司）；TDL-5000B型低速冷凍離心機（上海世義精密儀器有限公司）；XW-80A型旋渦混合器（上海醫科大學儀器廠）；SSC-24恒溫搖床，SSC-24恒溫搖床，AF10制冰機（美國SCOTSMAN公司）；垂直電泳儀（Bio-Rad Power/PAC 3000，美國Bio-Rad公司）；Quick-Reference imaging guide FluorChem?多功能顯像儀（美國Alpha Innotech公司）。

1.4 實驗方法

1.4.1 細胞培養實驗選用對數生長期細胞，37℃、體積分數為5% CO2、完全飽和濕度條件下，使用DMEM完全培養基（含10%熱滅活胎牛血清），常規培養HSC-T6細胞。每48 h更換培養基，細胞生長鋪滿培養瓶底約80%后，以0.25%胰蛋白酶加0.02% EDTA消化傳代。

1.4.2 細胞干預1）常規消化對數生長期的大鼠肝星狀細胞HSC-T6，制備單細胞懸液，按每孔1×104/100μL接種于培養板中，24 h貼壁后干預。2）分為空白組（DMSO在37℃處理24 h），雌激素受體完全拮抗劑（FulvestrantICI182.780，ICI）組（用1μM ICI-182780在37℃處理24 h），雌激素受體α特異性拮抗劑｛（1，3-Bis-（4-hydroxyphenyl）-4-methyl-5-［4-（2-piperidinylethoxyphenol）-1H-pyrazole dihydrochloride，MPP］組（用1μM MPP在37℃處理24 h），雌激素受體β特異性拮抗［（R，R）-5，11-Diethyl-5，6，11，12-tetrahydro-2，8-chrysenediol THC］組（用1μM THC在37℃下處理24 h）。每組分為如下4個亞組：對照組（DMSO在37℃處理24 h，然后DMSO在37℃處理4 h）、模型組（DMSO在37℃處理24 h，然后在H2O2在37℃處理4 h）、SSd組（用5μM SSd在37℃處理24 h時，然后在37℃用H2O2處理4 h）、E2組（用1μM E2在37℃處理24 h，然后H2O2在37℃處理4 h）。每孔加入藥物，每個濃度設6個復孔。

1.5 觀察指標RT-PCR半定量檢測HSC-T6細胞TGFβ1、Smad3/7 mRNA的表達：Trizol法抽提細胞總RNA，進行RT-PCR擴增。擴增條件：94℃5 min，72℃延伸5 min。取RT-PCR產物4μL，加上樣緩沖液1μL，在1.5%瓊脂糖凝膠（含EB）上電泳，80 V，45 min，用UVP凝膠圖像成像系統，拍攝打印實驗結果，用凝膠圖像分析系統（Gel-Pro Analyzer Version 3.0）分析結果。求出每條條帶的密度值，以GAPDH PCR產物作為內參照。引物序列見表1。

表1 基因引物序列

1.6 統計學方法數據采用SPSS 16.0軟件進行統計學分析，多組間比較采用ANOVA行單因素方差分析，并行兩兩比較，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 細胞總RNA的抽提鑒定紫外分光光度法分析HSC-T6細胞總RNA（Trizol法抽提所得）純度及濃度；瓊脂糖凝膠電泳確定RNA的完整性。結果表明，樣品A260/A280的值均介于1.6～2.0之間；RNA完整性保持良好。見圖1。

圖1 瓊脂糖凝膠確定RNA完整性電泳圖

2.2 實時熒光定量RT-PCR擴增曲線和溶解曲線結果顯示，擴增曲線基線平整，起跳良好，溶解曲線形成單峰，說明引物特異性良好。見圖2。

圖2 實時熒光定量RT-PCR擴增曲線和溶解曲線圖

2.3 SSdHSC-T6細胞TGFβ1、smad3/7 mRNA水平的調節作用與空白組比較，模型組中TGFβ1、smad3、smad7 mRNA的表達差異有統計學意義（P＜0.05）。與對照組比較，模型組TGFβ1表達升高（P＜0.05），SSd和E2能夠降低TGFβ1表達，此種作用可被ICI-182780和THC抑制，兩組TGFβ1mRNA表達與空白組對應亞組比較，差異均有統計學意義（P＜0.05）。MPP對藥物的抑制作用不明顯，差異無統計學意義（P＞0.05）。Smad3在模型組中高表達，差異有統計學意義（P＜0.05）。Smad3表達在SSd和E2處理后明顯降低，與模型組比較，差異有統計學意義（P＜0.05），此種作用可被ICI-182780和THC抑制，兩組Smad3 mRNA表達與空白組對應亞組比較，差異均有統計學意義（P＜0.05）。MPP對藥物的抑制作用不明顯，差異無統計學意義（P＞0.05）。與空白組比較，Smad7在模型組中均降低（P＜0.05）。SSd和E2能夠升高Smad7表達，同時ICI-182780和THC可抑制此種作用，兩組Smad7 mRNA表達與空白組對應亞組比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。MPP對藥物的抑制作用不明顯，差異無統計學意義（P＞0.05）。見圖3—5。

圖3 氧化應激的HSC-T6細胞中TGFβ1表達

圖4 氧化應激的HSC-T6細胞中Smad3表達

圖5 氧化應激的HSC-T6細胞中Smad7表達

3 討論

肝纖維化發病是個非常復雜的動態過程，受外界刺激引起的細胞因子釋放，細胞與細胞外基質相互作用等多種因素影響，導致大量纖維組織沉積于肝臟，最終形成肝纖維化［5-9］。抑制TGFβ1的表達這個靶點，在抗肝纖維化中有重要作用。正常情況下，TGFβ1表達極少，但肝損傷時其表達明顯增加。TGFβ1受體分為TGFβ1Ⅰ型受體（TβRⅠ）和TGFβ1Ⅱ型受體（TβRⅡ），均為跨膜糖蛋白，屬絲氨酸/蘇氨酸激酶型受體。TβR I與TβRⅡ自身激活體結合形成異源四聚體，磷酸化后活化，作用于胞漿Smads蛋白，啟動信號轉導。Smads蛋白由氨基端和羧基端的保守序列MH1（Mad—Homology domain1）、MH2及富含脯氨酸的連接區組成［10-11］。靜息Smad蛋白中，MH1與MH2相互抑制。MH1可與DNA結合，MH2與細胞核內的一些轉錄因子結合并調節TGFβ1，目標基因的表達，Smads的連接區含有其他調節因子結合的結構域。Smads蛋白按其結構和功能分為3種亞型：1）受體調節 型Smads（R-Smads），包括對應于TGFβ1和Activin的Smad2、3，和對應于BMP的Sma dl、5、8；2）共同通路型Smad蛋白（Co-Smad），即Smad4；3）抑制型Smads（Ⅰ-Smads），包括分別對應于TGFβ1、Activin的Smad7和 對 應 于BMP的Smad6［12］。Smads蛋白家族，是現階段被確認為細胞內唯一的TGFβ1，R1激酶底物，是TGFβ1由膜受體到內目標基因信號轉導途徑的中心環節。

前期研究發現，SSd具有類雌激素樣作用，是一種雌激素受體調節劑［13-14］。這個現象提示我們將SSd的抗炎保肝作用與雌激素受體通路聯系起來。不可否認肝硬化臨床發病與性別有關，發病率男女性別之比約為2.6～3.6∶1，且絕大多數女性肝硬化患者為絕經后婦女［15-16］，性別作為獨立的危險因子，可加快慢性肝病向肝硬化轉變的進程，顯示性激素對肝纖維化的發展起著重要的抑制作用。雌激素抗肝纖維化的相關研究資料證實，肝細胞、肝竇內皮細胞、枯否細胞和星狀細胞均存在雌激素受體；雌激素能夠改善受損肝臟的微循環，抑制活化的HSC的增殖和膠原的合成，促進肝細胞中抗氧化酶-GPx的活性，抗脂質過氧化，調節轉化生長因子等細胞因子表達等，抑制肝纖維化發生發展［17-22］。由此我們推測，SSd保肝抗炎、抗肝纖維化作用是通過雌激素受體途徑實現的。

本實驗結果顯示，經H2O2刺激后，HSC-T6細胞促纖維化指標明顯增加，E2、SSd作用細胞24 h后，細胞內TGFβ1、Smad3表達低于模型組，Smad7表達增多，起到抗纖維化進程的作用。此種作用可被ER完全拮抗劑和ERβ拮抗劑拮抗，提示SSd對纖維化細胞因子的影響可能是通過ER途徑發揮作用，并且主要通過ERβ亞型進行干預，此結果也驗證了我們的推測。

綜上所述，TGFβ-Smad通路在肝纖維化的形成及進展過程中發揮很大作用，可以促進HSC的增殖和活化，促進其分泌大量膠原，并減少膠原的降解導致大量膠原異常沉積，表現出促進肝纖維化的作用。而SSd通過雌激素受體途徑實現保肝抗炎、抗肝纖維化作用。