甘薯IbSUT1基因的克隆及在不同濃度氮肥和烯效唑處理下的基因表達(dá)

秦 楨， 齊素坤， 侯夫云， 李愛賢， 董順旭， 周媛媛， 王慶美*

(1.山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 作物研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部黃淮海薯類科學(xué)觀測(cè)實(shí)驗(yàn)站，山東 濟(jì)南 250100；2.河北省唐山市開平區(qū)市場(chǎng)監(jiān)督管理局，河北 唐山 063021)

甘薯是重要的貯藏根類糧食作物，其光合作用產(chǎn)物除供給植物體生長發(fā)育之外，經(jīng)過莖轉(zhuǎn)運(yùn)到地下部，主要以淀粉的形式儲(chǔ)存在貯藏根中.

蔗糖是光合作用產(chǎn)物從葉片向外周組織運(yùn)輸?shù)闹饕问絒1]，蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(sucrose transporters,SUTs)參與了這個(gè)過程[2].蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是一種蔗糖/H+共轉(zhuǎn)運(yùn)體，具有12個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域的膜蛋白[3]，利用H+-ATP泵在植物細(xì)胞膜內(nèi)外建立質(zhì)子濃度梯度，進(jìn)行蔗糖的跨膜運(yùn)輸[4].根據(jù)系統(tǒng)發(fā)生學(xué)，將已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白分為5個(gè)亞族，分別為SUT1、SUT2、SUT3、SUT4和SUT5[5].它們?cè)谡崽菑脑吹綆斓倪\(yùn)輸調(diào)控中發(fā)揮核心作用，從而決定植物的生長和發(fā)育[6].根據(jù)參與不同的蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)步驟，SUTs可以分為3類：質(zhì)膜外排載體、質(zhì)膜內(nèi)流載體和液泡質(zhì)體載體[7].蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)體首先在菠菜中克隆獲得，并在酵母中進(jìn)行了功能驗(yàn)證[8].蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在維持植物體內(nèi)蔗糖平衡以及調(diào)節(jié)源-庫間蔗糖的分配中起重要作用，參與植物多種生長發(fā)育過程.

現(xiàn)有的研究主要是蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)基因的表達(dá)及對(duì)逆境環(huán)境的適應(yīng)[9].甘薯是貯藏根類作物，在生產(chǎn)上，合理地調(diào)節(jié)源-庫關(guān)系是影響甘薯產(chǎn)量的一個(gè)重要因素，而蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)體在將光合器官合成的蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)到庫器官(甘薯貯藏根)的過程中起重要作用.本試驗(yàn)克隆了甘薯IbSUT1基因，研究其亞細(xì)胞定位和基因表達(dá)情況，分析生產(chǎn)上常用的施加氮肥和外源施加烯效唑等生產(chǎn)措施對(duì)基因表達(dá)情況的影響，有利于揭示基因調(diào)控機(jī)理，指導(dǎo)生產(chǎn)實(shí)踐.另外，對(duì)光合作用產(chǎn)物從葉片經(jīng)莖到貯藏根轉(zhuǎn)運(yùn)過程的研究將拓展我們對(duì)光合作用產(chǎn)物轉(zhuǎn)運(yùn)的認(rèn)識(shí)，對(duì)增加甘薯貯藏根產(chǎn)量有指導(dǎo)意義.

1 材料與方法

1.1 濟(jì)薯25組織取樣

8月中旬,分別選取濟(jì)薯25的成熟完整葉(第4～5片)、莖(取樣葉片下方)和貯藏根.每個(gè)樣品來自3個(gè)不同的植株，用錫箔紙包裹，液氮速凍，-80 ℃冰箱保存.

1.2 IbSUT1蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)分析

利用在線軟件(https://swissmodel.expasy.org/)分析IbSUT1蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)，選擇“BuildModel”模式進(jìn)行分析.

1.3 氮素處理

選取18株長勢(shì)一致的濟(jì)薯25幼苗移栽在18個(gè)花盆中，花盆中放置等量沙土，隨機(jī)平均分為3組進(jìn)行氮素(尿素)水平處理，氮素有效成分濃度分別為4 mmol/L(N1)、10 mmol/L(N2)、16 mmol/L(N3)，以N1為對(duì)照.定期澆等量1/2 Hoagland營養(yǎng)液，保持水分充足.移栽后60 d，每個(gè)處理隨機(jī)選取3個(gè)植株，分別取根、莖、葉，處理方法如1.1.對(duì)不同處理的甘薯貯藏根，烘干后稱干質(zhì)量.

1.4 烯效唑處理

選取18株長勢(shì)一致的濟(jì)薯25幼苗移栽在18個(gè)花盆中，花盆中放置等量營養(yǎng)土，定期澆等量的水，保持水分充足.半個(gè)月后，隨機(jī)平均分為3組，葉面分別噴施0 mol/L(CK)、50 mol/L(T1)、75 mol/L(T2)的等量烯效唑溶液，4 d后，每個(gè)處理隨機(jī)選取3個(gè)植株，分別取根、莖、葉，處理方法同前.

1.5 數(shù)據(jù)處理

測(cè)定的數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel整理作圖，用Excel方差分析選項(xiàng)進(jìn)行顯著性分析.

2 結(jié)果與分析

2.1 IbSUT1基因的克隆

試驗(yàn)提取濟(jì)薯25葉片的mRNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，克隆獲得IbSUT1基因，測(cè)序分析發(fā)現(xiàn)，開放閱讀框全長為1 512個(gè)核苷酸(圖1a)，編碼503個(gè)氨基酸，其分子量53.21 kD，預(yù)測(cè)等電點(diǎn)8.45.提取濟(jì)薯25的基因組DNA，克隆獲得了IbSUT1基因的基因組全長序列，測(cè)序分析發(fā)現(xiàn)，基因全長為1 818個(gè)核苷酸(圖1b)，包含3個(gè)內(nèi)含子和4個(gè)外顯子(圖1c).

圖1 IbSUT1基因cDNA(a)和gDNA(b) PCR產(chǎn)物瓊脂糖電泳圖和基因結(jié)構(gòu)圖(c)

2.2 IbSUT1蛋白亞細(xì)胞定位分析

三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，IbSUT1蛋白是一個(gè)含有12個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域的膜定位蛋白(圖2a).試驗(yàn)構(gòu)建pBI221-IbSUT1-GFP融合表達(dá)載體，在擬南芥原生質(zhì)體中瞬時(shí)表達(dá)，利用激光共聚焦顯微鏡觀察融合蛋白的亞細(xì)胞定位，發(fā)現(xiàn)IbSUT1蛋白定位在細(xì)胞質(zhì)膜上(圖2b).

圖2 IbSUT1蛋白三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析(a)和擬南芥原生質(zhì)體定位(b)

2.3 IbSUT1基因表達(dá)譜分析

將1.1中提取的濟(jì)薯25葉片、莖、根的mRNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以IbACTIN為內(nèi)參基因，對(duì)其表達(dá)譜進(jìn)行定量分析(圖3)，發(fā)現(xiàn)IbSUT1基因在葉片、莖、根中都有表達(dá)，其中:在葉片中表達(dá)量最高，莖中次之，根中最低，且它們之間的差異顯著(P<0.05,下同).

圖3 濟(jì)薯25 IbSUT1基因表達(dá)譜分析

2.4 氮素處理對(duì)IbSUT1基因表達(dá)的影響

氮是甘薯生長的必要營養(yǎng)元素，對(duì)促進(jìn)甘薯生長和提高甘薯產(chǎn)量發(fā)揮重要作用.為探究IbSUT1基因的功能，我們?cè)O(shè)計(jì)了氮素處理試驗(yàn).取其成熟葉片、莖、根，提取mRNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，qRT-PCR定量分析發(fā)現(xiàn)(圖4)：隨著氮濃度的增加，與對(duì)照相比，IbSUT1在葉片和莖中的表達(dá)量顯著增加,而在根中的表達(dá)量顯著降低.烘干后稱量貯藏根產(chǎn)量發(fā)現(xiàn)，隨著施加氮素量的增加，甘薯貯藏根干物質(zhì)量增加，其中N3處理的產(chǎn)量比對(duì)照顯著增加.

圖4 不同濃度氮素處理對(duì)葉、莖、根IbSUT1基因表達(dá)和貯藏根產(chǎn)量的影響

2.5 烯效唑處理對(duì)IbSUT1基因表達(dá)的影響

烯效唑是一種高效的植物生長調(diào)節(jié)劑.在甘薯的生長過程中，葉面噴施烯效唑能有效抑制甘薯地上部的生長，增加地下部貯藏根產(chǎn)量.選取盆栽長勢(shì)一致的濟(jì)薯25，噴施等量不同濃度的烯效唑，4 d后取樣,采用qRT-PCR方法測(cè)定IbSUT1基因表達(dá)量，以未施加烯效唑的處理為對(duì)照，結(jié)果表明(圖5)，烯效唑處理后，IbSUT1基因在葉片、莖中表達(dá)量升高，在根中表達(dá)量降低，與對(duì)照相比，差異顯著.

圖5 不同濃度烯效唑處理對(duì)葉(a)、莖(b)、根(c)IbSUT1基因表達(dá)的影響

3 討論與結(jié)論

甘薯貯藏根中的淀粉是葉片光合作用產(chǎn)物以蔗糖的形式在蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)體的作用下，從葉片經(jīng)過莖轉(zhuǎn)運(yùn)到貯藏根中合成的，蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)體在這個(gè)過程中發(fā)揮重要作用[10].

SUTs家族在植物中最典型的作用是將蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)至韌皮部中，實(shí)現(xiàn)長距離運(yùn)輸.在煙草中，通過反義RNA試驗(yàn)，證明NtSUT1通過質(zhì)外體途徑將蔗糖裝載到韌皮部[11].OsSUT1在水稻多種部位中表達(dá)，其在葉片、葉鞘等部位的表達(dá)量較高[12-13].玉米ZmSUT1基因在葉片和根中都有表達(dá)，且葉片中的表達(dá)量明顯高于根中[14].我們?cè)囼?yàn)發(fā)現(xiàn),甘薯IbSUT1基因在甘薯葉片、莖、根中都有表達(dá)，且在葉片中表達(dá)量最高，莖中次之，根中最低.

SUT1基因的表達(dá)受到多因素調(diào)控.Marco等研究發(fā)現(xiàn),植物菌原體影響NtSUT1的表達(dá)[15].花生AhSUT1基因表達(dá)受到非生物脅迫,如低溫、干旱、鹽脅迫的影響[16].芹菜AgSUT1基因在鹽脅迫條件下表達(dá)量降低[9].水稻OsSUT1基因表達(dá)受到磷元素的影響[17].在缺磷的條件下，玉米葉片中ZmSUT1基因的表達(dá)上調(diào)[14].我們發(fā)現(xiàn),IbSUT1基因表達(dá)受到氮素和烯效唑的影響.在適量的氮素條件下，隨著氮素含量的增加，葉片和莖中IbSUT1基因表達(dá)上調(diào).噴施不同濃度的烯效唑，葉片和莖中IbSUT1基因表達(dá)也上調(diào).已有的研究表明，SUT1家族對(duì)蔗糖的韌皮部裝載和長距離運(yùn)輸起著非常關(guān)鍵的作用，OsSUT1基因很大程度上決定了籽粒的充實(shí)情況[18].我們發(fā)現(xiàn),隨著IbSUT1基因表達(dá)量的上調(diào)，貯藏根產(chǎn)量也相應(yīng)地增加，說明IbSUT1蛋白質(zhì)參與了甘薯中蔗糖的長距離運(yùn)輸.

綜上所述，IbSUT1基因在甘薯葉片、莖和根中都有表達(dá)，且在葉片中表達(dá)量最高，其表達(dá)情況受外源施加氮素和烯效唑的影響;IbSUT1是一個(gè)細(xì)胞質(zhì)膜定位的跨膜蛋白質(zhì)，參與了蔗糖在葉片和莖中的轉(zhuǎn)運(yùn)過程.