水培法鑒定甘薯抗甘薯瘟病技術(shù)的構(gòu)建

張 鴻, 林志堅, 林趙淼, 李國良, 許泳清, 劉中華, 邱永祥, 邱思鑫

(福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 作物研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部南方薯類科學(xué)觀測實驗站/福建省特色旱作物育種工程技術(shù)研究中心,福建 福州 350013)

甘薯瘟病是對我國南方甘薯產(chǎn)區(qū)威脅最大的細(xì)菌性病害,主要分布于廣東、廣西、福建、浙江、湖南、江西和臺灣等省份,發(fā)病田塊產(chǎn)量一般損失20%～30%,重者可達(dá)60%～70%,甚至全田絕收[1].甘薯瘟病的病原菌為青枯菌(Ralstoniasolanacearum),在青枯菌中屬于演化型Ⅰ型,1號生理小種,15號序列變種[2-3].甘薯瘟病為維管束病害,病原菌能在土壤中長期存活,且目前尚未有特效防治藥,控制該病發(fā)生的最經(jīng)濟(jì)有效的措施就是選育和應(yīng)用抗病甘薯品種.

準(zhǔn)確穩(wěn)定的甘薯抗病性鑒定方法是抗病品種選育的前提.普遍認(rèn)為，青枯菌從植物根莖部傷口或自然孔口侵入,先在皮層、細(xì)胞間隙等處定殖,隨后在植物導(dǎo)管及附近組織內(nèi)大量繁殖,并分泌胞外多糖堵塞導(dǎo)管,破壞周圍組織,最終使植物萎蔫死亡[4].因此,最接近生產(chǎn)實際的鑒定方法就是利用病圃地鑒定,鑒定過程包括甘薯整個生育期,最后通過甘薯地上部植株和地下部薯塊維管束病變程度進(jìn)行抗性評價.但是,這種方法對時間、空間、人力及物力的消耗較大.從1985年起,方樹民等[5-10]就陸續(xù)研究更為簡便且不失準(zhǔn)確的室內(nèi)接種甘薯瘟病菌的鑒定方法,如剪葉法、刺葉法、刺莖法、剪苗留莖法、浸苗法、浸根法等,以及各種接種方法結(jié)合粗毒素測定法.其中,剪葉法被認(rèn)為是發(fā)病最快、致病作用強(qiáng),對病情可目測檢查的最優(yōu)鑒定方法.這種方法一直沿用至今,與病圃地種植鑒定相結(jié)合,用于現(xiàn)行生產(chǎn)上甘薯瘟病抗性鑒定. 然而,剪葉法也存在局限性.利用葉脈發(fā)病程度對甘薯進(jìn)行抗病性評價,不同品種間葉型、葉片長短不一,影響病程發(fā)展觀察.其次,剪葉法對葉表濕度要求很高,檢測結(jié)果受環(huán)境空氣濕度的影響大.

水培法常用于室內(nèi)鑒定茄科作物對青枯病的抗性,尚未見在甘薯上應(yīng)用.相比于剪葉法,其優(yōu)勢在于:1)病程在莖部發(fā)展,更接近甘薯瘟病實際發(fā)病情況;2)莖部較長,利于發(fā)病程度評價;3)對環(huán)境空氣濕度要求較低;4)不需逐片處理葉子,統(tǒng)一莖部剪切造傷更為省時省力.前期研究表明，直接用甘薯瘟病菌懸浮液浸泡接種甘薯并不能使甘薯感病品種正常發(fā)病,無法進(jìn)行甘薯材料抗病性評價.因此,本研究根據(jù)甘薯瘟病菌侵染規(guī)律和自然發(fā)病所需關(guān)鍵條件,從接種菌體濃度、水體通氣量、接種介質(zhì)等方面展開試驗,確定水培環(huán)境下鑒定甘薯抗甘薯瘟病的最適條件,旨在為優(yōu)化和豐富甘薯瘟病抗病材料鑒定方法提供借鑒.

1 試驗材料與方法

1.1 試驗材料

甘薯瘟病菌Ⅰ、Ⅲ型供試菌株由農(nóng)業(yè)農(nóng)村部南方薯類科學(xué)觀測實驗站保存.甘薯品種新種花、金山57和湘薯75-55取自福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所薯類研究室種質(zhì)資源圃.

1.2 試驗方法

1.2.1 培養(yǎng)基配制CPG培養(yǎng)基:每1 L培養(yǎng)基含有葡萄糖10 g,蛋白胨10 g,酸水解酪蛋白1 g, pH值7.2.CPG-TTC固體培養(yǎng)基:每1 L CPG培養(yǎng)基加入15 g瓊脂,滅菌后,在培養(yǎng)基冷凝前,加入1%體積的TTC(2,3,5-氯化三苯四氮唑)母液(0.5%體積的TTC)再制板,TTC采用過濾滅菌,常溫避光保存.

1.2.2 甘薯瘟病菌培養(yǎng)與生長曲線測定將-80 ℃保存的甘薯瘟病菌取出,用無菌接種針蘸取菌液在CPG-TTC培養(yǎng)基平板上劃線,28 ℃培養(yǎng).待單菌落長出后,挑取單菌落到CPG液體培養(yǎng)基,28 ℃,180 r/min培養(yǎng)至A600 nm為1,備用.活化培養(yǎng)的菌液按1%(體積分?jǐn)?shù))的接種量接種到CPG培養(yǎng)基中,250 mL三角瓶裝液量100 mL,在往復(fù)式恒溫振蕩器上培養(yǎng),振蕩頻率180 r/min,溫度28 ℃,懸浮培養(yǎng)0、1、2、3、4、6、8、10、12、14、16、20、24、28、36 h后取菌液,測定其A600 nm,作出其生長曲線.

1.2.3 通氣水培法鑒定甘薯抗甘薯瘟病的最佳接種濃度和通氣時間測定將在CPG中培養(yǎng)至對數(shù)生長期的甘薯瘟病菌培養(yǎng)液用1/2MS液體配制成1×105、1×106、 1×107、1×108CFU/mL 4個濃度梯度的懸浮液(pH 6～7),剪取甘薯品種新種花和湘薯75-55的莖頂部約20 cm,插于不同濃度的甘薯瘟病菌懸浮液中培養(yǎng).使用松寶牌4孔988型號制氧機(jī)最低檔通氣量,800 mL水培體積加入一個氣泡石,用定時開關(guān)將通氧時間調(diào)節(jié)至0、1、30 min/h和全時段通氧等4個梯度.設(shè)置不同接種濃度和通氣時間，共16個處理,每處理10株,重復(fù)3次,于30 ℃,16 h光/8 h暗光周期下培養(yǎng).待發(fā)病效果好的新種花處理達(dá)高感水平時統(tǒng)計各處理發(fā)病結(jié)果,分級標(biāo)準(zhǔn)參照土壤盆栽法.

1.2.4 甘薯抗甘薯瘟病的接種鑒定方法1)剪葉法(切葉法).在方樹民等方法[10]基礎(chǔ)上進(jìn)行改進(jìn):①接種前2～3 d,剪取甘薯苗頂部約20 cm莖，扦插于1/2MS營養(yǎng)液中;②用無菌的手術(shù)刀蘸取濃度為1×108CFU/mL 的甘薯瘟病菌懸浮液，在甘薯葉片靠近葉尖約1/5葉片長度的位置將主脈切斷(手術(shù)刀每切斷1片葉的主脈前需重新蘸取菌液);③接種后，對葉片進(jìn)行噴霧至葉面濕潤，但不滴水,接種植株插于營養(yǎng)液中,置于光照培養(yǎng)箱中30 ℃,95%濕度,16 h光/8 h暗光周期培養(yǎng).每個重復(fù)至少接種10片葉,3次重復(fù),以蘸取清水的切脈處理為對照.待新種花處理發(fā)病達(dá)高感水平時，對各處理發(fā)病結(jié)果進(jìn)行調(diào)查統(tǒng)計.根據(jù)葉脈發(fā)病長度進(jìn)行病害分級統(tǒng)計:0級,葉脈不變色;1級,葉脈變黃褐色部分<切口以上長度的1/4;3級,葉脈變黃褐色部分占切口以上葉片長度的1/4～2/4;5級,葉脈變黃褐色部分占切口以上葉片長度的2/4～3/4;7級,葉脈變黃褐色部分>切口以上葉片長度的3/4;9級,葉脈全變黃,葉片萎蔫.

2)土壤盆栽法和定植塊水培法.在田間剪取健康的甘薯苗頂部約20 cm莖段,將傷口朝下浸泡入1×108CFU/mL、pH 6～7的甘薯瘟病菌懸浮液中20 min,取出栽插于無病盆土中生長,或于奧賽斯定植塊(酚醛樹脂基質(zhì))中進(jìn)行水培.土壤盆栽通過澆水保濕,定植塊置于淺水盤中(加1 cm高水位的1/2MS液體)保濕,每個重復(fù)至少接種10個莖段,3次重復(fù),以清水浸泡的苗為對照,于30 ℃,16 h光/8 h暗光周期下培養(yǎng).接菌后,以甘薯新種花品種發(fā)病達(dá)高感水平時,對各處理進(jìn)行發(fā)病情況調(diào)查統(tǒng)計.依據(jù)莖部維管束發(fā)病長度進(jìn)行病害分級統(tǒng)計:0級,維管束不變色;1級,維管束變色長度<莖段長的1/4;3級,維管束變色長度占莖段長的1/4～2/4;5級,維管束變色長度占莖段長的2/4～3/4;7級,維管束變色長度>莖段的3/4;9級,全株萎蔫.

3)通氣水培法.在通氣水培法鑒定甘薯抗甘薯瘟病接種濃度和通氣時間優(yōu)化的基礎(chǔ)上,將培養(yǎng)好的甘薯瘟病菌用1/2MS液體配制成1×107CFU/mL 、pH 6～7的懸浮液作為甘薯水培液,田間剪取健康的甘薯苗頂部約20 cm的莖段,栽插于水培液中,全時段通氣,于30 ℃,16 h光/8 h暗光周期下培養(yǎng).每個處理至少接種10個莖段,3次重復(fù),以未加菌的培養(yǎng)液作對照.病害調(diào)查參照土壤盆栽法和定植塊水培法.

1.2.5 甘薯抗甘薯瘟病的評價病情指數(shù)

其中:ni(i=1,3,5,7,9)為對應(yīng)發(fā)病級別病株數(shù)(剪葉法為葉片數(shù))，N為參試總株數(shù)(剪葉法為葉片數(shù)).

根據(jù)病情指數(shù)評價甘薯對甘薯瘟病的抗性,將甘薯品種劃分為高抗、抗病、中抗、感病、高感共5個抗性類型,評定標(biāo)準(zhǔn):高抗，I≤5.0;抗病，5.0

2 試驗結(jié)果與分析

2.1 甘薯瘟病菌的生長曲線

用比濁法測定Ⅰ、Ⅲ型甘薯瘟病菌生長曲線,以A600 nm為縱坐標(biāo),培養(yǎng)時間為橫坐標(biāo)作病菌的生長曲線.由圖1知，Ⅰ型甘薯瘟病菌在10～12 h進(jìn)入對數(shù)生長期,Ⅲ型甘薯瘟病菌在12～14 h進(jìn)入對數(shù)生長期.Ⅰ、Ⅲ型甘薯瘟病菌均在20 h到達(dá)生長峰值,之后菌量下降.因此，進(jìn)行甘薯抗甘薯瘟病鑒定宜用28 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)20 h的菌液.

圖1 Ⅰ型(a)、Ⅲ型(b)甘薯瘟病菌生長曲線

2.2 通氣水培法鑒定甘薯瘟病菌的最佳接種濃度和通氣時間

接種后21 d(表1),在不通氣的情況下,感病品種新種花的發(fā)病情況不理想,植株表現(xiàn)在中抗到抗病水平,不符合實際情況.在通氣的情況下,隨著接種菌體濃度的增加,甘薯發(fā)病程度遞增,在通氣時間60 min/h的情況下,接種濃度>1×107CFU/mL,甘薯發(fā)病達(dá)到高感水平.相同病菌的接種濃度,隨著通氣時間的增加,甘薯發(fā)病程度也呈現(xiàn)遞增趨勢.通氣15 min/h,接種濃度1×107CFU/mL,新種花發(fā)病程度達(dá)到感病水平;通氣30 min/h,接種濃度1×108CFU/mL,以及通氣60 min/h,接種濃度1×107、1×108CFU/mL,新種花發(fā)病達(dá)到高感水平.但是,觀察甘薯抗病品種湘薯75-55的發(fā)病水平發(fā)現(xiàn),在通氣情況下,湘薯75-55的發(fā)病程度也會隨著接種濃度的增加而遞增,當(dāng)接種濃度達(dá)到1×108CFU/mL 時,湘薯75-55的抗性水平由抗病變?yōu)橹锌?與實際情況有偏差.

表1 病菌接種濃度和通氣時間對甘薯瘟發(fā)病的影響

因此,綜合考慮不同通氣時間、接菌濃度下甘薯抗、感鑒別品種的發(fā)病情況,確定室內(nèi)水培條件下甘薯抗病鑒定最佳接種濃度為1×107CFU/mL,最佳通氣時間為60 min/h,即全時段通氣.

此外,水培條件下不通氣或通氣不足時,隨著浸泡時間的增加,甘薯莖段受到厭氧雜菌污染概率上升,常發(fā)現(xiàn)從底端向上的軟腐癥狀,影響抗病鑒定的準(zhǔn)確性.但是,在通氣情況下,厭氧菌滋生受抑制,未發(fā)病情況下甘薯根系生長良好,發(fā)病甘薯苗的維管束變色癥狀典型.這從另一角度說明了在水培甘薯抗病鑒定方法中通氣的重要性.

2.3 水培法鑒定甘薯抗甘薯瘟病的效果評價

以甘薯瘟病抗性鑒定對照品種新種花、金山57和湘薯75-55為供試品種,選擇通氣水培法鑒定甘薯抗甘薯瘟病的最佳接種濃度和通氣組合,并進(jìn)行可靠性評價.同時,在明確了通氣對甘薯瘟病發(fā)病的重要性基礎(chǔ)上,選擇通氣性和保濕性良好的多孔基質(zhì)定植塊替代傳統(tǒng)土壤基質(zhì)栽插,進(jìn)行抗病性評價.將通氣水培法、多孔定植塊水培法與傳統(tǒng)的剪葉法和土壤盆栽法鑒定結(jié)果進(jìn)行比較,以評價水培法鑒定結(jié)果的可靠性.結(jié)果表明,剪葉法在接種后5～7 d,土壤盆栽法及通氣水培法接種后14～21 d,定植塊水培法接種后7～10 d可達(dá)病害鑒定統(tǒng)計要求.定植塊水培法在7～10 d后即可觀察到甘薯感病品種出現(xiàn)顯著的萎蔫癥狀(圖2).

圖2 定植塊基質(zhì)水培法抗病鑒定效果圖(7 d)

從試驗結(jié)果的統(tǒng)計分析看,剪葉法、土壤盆栽法與通氣水培法和定植塊水培法抗病鑒定結(jié)果一致,即新種花對Ⅰ、Ⅲ型薯瘟病菌高感,金山57對Ⅰ型薯瘟病菌抗病、Ⅲ型薯瘟病菌高感,湘薯75-55對Ⅰ型薯瘟病菌抗病、Ⅲ型薯瘟病菌感病(表2),表明兩種水培法均可用于甘薯抗甘薯瘟病鑒定.但是,相比于同為甘薯莖部發(fā)病的通氣水培法和土壤盆栽法所需鑒定時間21 d,定植塊基質(zhì)水培法所需的鑒定時間能縮短到10 d,更為省時.

表2 4種栽培法對甘薯瘟病抗性鑒定方法的效果比較

3 討論與結(jié)論

青枯病是維管束病害,對于植物苗期青枯病抗性鑒定,常用的方法有莖或葉維管束針刺、注射、剪葉法、水培浸根法、土培灌根法等[11-14].利用水培法進(jìn)行青枯病抗性鑒定主要有下列優(yōu)點:1)菌體能充分且均勻地接觸侵染部位;2)相比于土壤接菌,可減少其他微生物或復(fù)雜理化環(huán)境干擾;3)省時省力,易于人工操作控制;4)適合短時間批量處理大量材料.目前，桉樹、番茄、辣椒、茄子等均能采用水培法進(jìn)行青枯病抗性鑒定[15-17].

引起青枯病的Ralstoniasolanacearum是好氧細(xì)菌.我們經(jīng)過多次試驗發(fā)現(xiàn),甘薯瘟病(又稱甘薯青枯病)抗性鑒定時,直接用其菌體懸浮液對薯苗進(jìn)行水培,甘薯無法正常發(fā)病.在田間自然誘發(fā)病圃鑒定甘薯瘟病抗性過程中,我們也發(fā)現(xiàn),土壤充分濕潤,但不積水的條件下,最適宜甘薯發(fā)病,缺水與長期泡水的狀態(tài)均會影響評價效果,表明濕度和微環(huán)境的透氣性均是影響甘薯瘟病發(fā)生的重要因素.因此,本研究通過提高水培環(huán)境中的含氧量來改進(jìn)甘薯瘟病抗性鑒定方法,分別采用了水體通氣水培法和多孔定植塊水培法進(jìn)行接種鑒定,2種方法均獲得與其他成熟方法一致的抗病鑒定結(jié)果.其中,通氣水培法的適宜條件為菌體接種濃度1×107CFU/mL 及全時段通氣,整個鑒定過程所需時間約為20 d.采取與土壤盆栽鑒定相同的菌體懸浮液接種濃度1×108CFU/mL,選用透氣保水性佳的定植塊基質(zhì)替代土壤進(jìn)行栽插,與土壤盆栽法相比，其鑒定時間大大縮短，僅為7～10 d.類似的結(jié)果在桉樹青枯病抗性鑒定中也有報道,冉隆賢等[17]認(rèn)為，液體培養(yǎng)系統(tǒng)操作簡單,苗木發(fā)病時間僅為盆栽苗木發(fā)病時間的1/3或1/2,且容易觀察苗木發(fā)病情況.但是,同為水培法,通氣水培法比多孔定植塊水培法病程發(fā)展要長,我們發(fā)現(xiàn)，水中通氣的清水對照甘薯根系顯著比不通氣的發(fā)達(dá),受腐生菌影響爛苗的概率也大大降低.推測通氧使植株更為健壯,提高了甘薯抗病能力,使病程發(fā)展延長.

影響青枯病抗性鑒定效果的因素主要有菌體濃度、環(huán)境溫度、濕度、pH值等.王勝坤等[14]用浸根法接種尾巨桉,確定30 ℃、pH 6～7和接種濃度高于3.0×108CFU/mL,最有利于青枯菌在尾巨桉根部吸附和侵入.王震[15]用傷根法接種番茄,確定32 ℃、pH 6.4、環(huán)境濕度高于80%、電導(dǎo)度(EC) 2.2 mS/cm和接種濃度6.3×108CFU/mL為青枯病發(fā)生最佳條件.王貽鴻[18]用菌體濃度為3.0×108CFU/mL混菌土接種煙草,確定pH 6～7的弱酸性到中性土壤中煙草青枯病發(fā)生最重.綜合文獻(xiàn)報道與甘薯瘟病抗性鑒定其他方法經(jīng)驗,本研究采用接種溫度30 ℃,pH 6～7,多孔定植塊水培法菌體接種濃度1×108CFU/mL.但是，通氣水培法菌體使用濃度為1×107CFU/mL，低于報道濃度,主要因為研究中高濃度菌液致使其他鑒定方法確定抗甘薯瘟Ⅰ型菌的對照品種湘薯75-55發(fā)病加重,呈現(xiàn)中抗水平,加之目前尚未發(fā)現(xiàn)對Ⅲ型甘薯瘟病菌抗病品種,適度調(diào)低菌濃度有利于篩選中抗或耐病品種供生產(chǎn)運(yùn)用.