作物氮高效利用的分子生物學(xué)研究及在甘薯上的研究展望

范文靜， 劉 明, 李鐵鑫， 吳德祥， 趙 鵬，靳 容, 張強(qiáng)強(qiáng)， 張愛君, 唐忠厚*

(1.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，安徽 合肥 230036； 2.江蘇徐州甘薯研究中心，江蘇 徐州 221131)

氮素是作物生長發(fā)育中不可缺少的營養(yǎng)元素之一，它不僅是構(gòu)成作物體內(nèi)許多重要化合物的組成元素，而且參與許多植物生長中的生理生化過程.2015年,我國推出化肥施用零增長計劃.據(jù)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部統(tǒng)計，2020年我國化肥利用率達(dá)到40.2%，實現(xiàn)了減量增效[1].過量施用氮肥不僅影響作物產(chǎn)量和品質(zhì)，還會造成土壤結(jié)構(gòu)破壞、水體富營養(yǎng)化和溫室氣體排放加劇等環(huán)境隱患，也導(dǎo)致氮利用相關(guān)基因的遺傳多樣性丟失.甘薯具有超高產(chǎn)、廣適、抗旱、耐瘠薄、易恢復(fù)生長等特點和抗癌保健功能，已成為鄉(xiāng)村振興、產(chǎn)業(yè)扶貧的先鋒作物和國內(nèi)糧食穩(wěn)產(chǎn)保供、抗災(zāi)奪豐收的潛力作物，其產(chǎn)量的穩(wěn)定增長對保障糧食安全有重要作用[2].甘薯生育期內(nèi)，氮素的吸收、同化效率對產(chǎn)量形成和薯塊品質(zhì)有很大影響.氮素過量會造成地上部徒長，降低薯塊形成期的氮利用效率(NUE)，抑制不定根形成層活動，加劇中柱細(xì)胞木質(zhì)化程度，影響?zhàn)B分的運(yùn)輸，不利于結(jié)薯[3].另外，我國較低的氮肥利用率出現(xiàn)了作物高肥低效的現(xiàn)象，增施氮肥的生產(chǎn)成本也加重了農(nóng)民的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，使得行業(yè)現(xiàn)狀不樂觀[4].NUE受基因型和環(huán)境影響較大，其調(diào)控網(wǎng)絡(luò)在氮素吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)、同化和再分配過程中有多種遺傳因子參與[5].因此，培育氮高效品種、利用基因組學(xué)分析氮高效基因的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，以此提高作物氮素利用效率是很有必要的[6].甘薯基因型差異與NUE息息相關(guān)[7]，農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上通過選育氮高效型品種提高作物NUE[8-9].這對定向改良甘薯品種具有重要意義，也可在一定程度上緩解農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和自然環(huán)境之間的矛盾.本文綜述了分子生物學(xué)領(lǐng)域作物氮素高效利用的研究進(jìn)展，包括氮高效遺傳位點定位和候選基因功能分析，并展望甘薯氮高效利用的研究方向.

1 氮高效候選基因的定位

1.1 QTL(quantitative trait locus)定位氮高效基因

隨著基因組學(xué)和功能基因組技術(shù)的成熟，氮高效型品種選育不再拘泥于傳統(tǒng)育種.近年來，國內(nèi)外學(xué)者利用多組學(xué)和分子生物學(xué)手段對植物中有關(guān)氮高效基因進(jìn)行挖掘和研究，解析其分子調(diào)控機(jī)制，為現(xiàn)代分子育種和遺傳改良提供了理論支持.

利用表型數(shù)據(jù)和一系列生物信息學(xué)分析挖掘某一作物的目的性狀連鎖基因的技術(shù)已經(jīng)相當(dāng)成熟[10].QTL定位被應(yīng)用于一些作物養(yǎng)分利用的遺傳研究，通過表型值和分子標(biāo)記間的連鎖不平衡來確定各個QTL在染色體上的位置、效應(yīng)以及互作效應(yīng)[11].QTL是染色體上控制數(shù)量性狀的基因座，受環(huán)境影響較大，因此,遺傳群體選擇越大越好.李培德[12]利用水稻RILs(重組自交系)作為供試材料，在不同氮素水平下共檢測到13個與氮利用效率性狀相關(guān)的QTLs.白建江[13]利用NUE高的秈稻品種和NUE低的粳稻品種TR22183作為雜交親本，構(gòu)建F9代穩(wěn)定遺傳的RILs，并對氮素籽粒生產(chǎn)效率等相關(guān)性狀進(jìn)行QTL定位分析，結(jié)果表明，有1個稻草氮素含量的主效QTL(qNCOS-4)在抽穗后15、25 d和成熟期均有表達(dá)效應(yīng)；抽穗15 d后，檢測到與氮效率性狀有關(guān)的主效QTLs有15個.王雨等[14]利用來源于9311(秈稻)與日本晴(粳稻)雜交后代衍生的遺傳背景為9311的染色體片段代換系群體，插入日本晴片段的CSSL(染色體片段代換系)群體，檢測到38個QTLs與2個氮素水平中的有效穗數(shù)、籽粒產(chǎn)量相關(guān)聯(lián).楊習(xí)武等[15]以水稻CSSLs為材料，對高低氮條件下的6個性狀進(jìn)行QTL鑒定，檢測到高氮條件下13個QTLs，低氮下10個QTLs，高低氮下12個，其中2個QTL熱點區(qū)中，第1條染色體短臂末端的QTL區(qū)段未被報道過.不同氮高效QTL位點調(diào)控不同的農(nóng)藝性狀，如在低氮脅迫下鑒定到控制水稻根長和根鮮質(zhì)量的2個QTL位點qRL1-1和qRFW2-1[16].高易宏等利用正向遺傳學(xué)手段發(fā)現(xiàn)了水稻中控制纖維素水平和氮利用效率的QTL共定位-轉(zhuǎn)錄因子MYB61，可被氮脅迫誘導(dǎo)表達(dá)，受氮代謝關(guān)鍵控制因子GRF4正向調(diào)控；而導(dǎo)致粳稻日本晴與秈稻9311纖維素合成和氮素利用效率差異的主要原因是前者插入轉(zhuǎn)座子helitron，下調(diào)MYB61表達(dá)[17].氮效率性狀的QTL定位研究大多在水稻[16]、小麥[18]、玉米[19]中，而甘薯中未見報道.

1.2 全基因組關(guān)聯(lián)分析(GWAS)定位氮高效基因

較之傳統(tǒng)QTL定位，近年來GWAS在解析植物數(shù)量性狀遺傳機(jī)制方面的應(yīng)用越來越廣，如用于鑒定和定位基因[20]，即在全基因組范圍內(nèi)找出單核苷酸多態(tài)性(SNP)變異位點，在LD(連鎖不平衡)較高水平下分辨率較高[21].GWAS中常用的分子標(biāo)記是SNP和插入/缺失多態(tài)性(InDel)等，前者是由單個核苷酸轉(zhuǎn)換、顛換、缺失和插入引起的變異，具有穩(wěn)定遺傳、位點豐富和特異性高等特點[22-23]；后者是指同源序列中核酸片段插入或缺失的現(xiàn)象，在基因組中廣泛分布，密度大，數(shù)目多[24].簡單重復(fù)序列(SSR)也是分子標(biāo)記的一種，劉智怡[25]利用GLM和MLM模型關(guān)聯(lián)到47個SSR標(biāo)記與氮素利用效率極顯著相關(guān)，并且通過對顯著關(guān)聯(lián)位點RM574進(jìn)行SNP標(biāo)記加密以及利用氮素響應(yīng)轉(zhuǎn)錄組圖譜，篩選出在氮素高效利用中發(fā)揮作用的LOC-Os03g19420基因；2019年，Tang等[26]在水稻群體中利用GWAS分析極端氮相關(guān)表型性狀，鑒定到了硝酸轉(zhuǎn)運(yùn)體OsNPF6.1HapB單倍型，其通過增強(qiáng)氮素吸收來提高NUE，該單倍型由轉(zhuǎn)錄因子OsNAC42差異反式激活；2021年,Yu 等[27]鑒定到與氮素同化相關(guān)的NIN-like轉(zhuǎn)錄因子OsNLP4，該基因通過結(jié)合其靶標(biāo)基因OsNiR啟動子上NREmotif(氮素回收轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合域)提高OsNiR轉(zhuǎn)錄水平和氮素同化水平.因此，利用GWAS關(guān)聯(lián)到顯著位點，篩選候選基因并利用RNAi等方法[10]對其進(jìn)行功能驗證，解析該位點在調(diào)控NUE通路中的應(yīng)答模式，構(gòu)建上下游基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò),是作物改良遺傳育種的重要方法[6].

2 氮高效候選基因的表達(dá)分析

2.1 氮素轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族基因功能研究

植物吸收轉(zhuǎn)運(yùn)銨態(tài)氮主要通過銨轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(AMTs)，其中OsAMT1.1、OsAMT1.2、OsAMT1.3屬于OsAMT1亞族，低氮環(huán)境中3者協(xié)同調(diào)控水稻生長和氮素吸收，在缺氮和不同銨鹽濃度處理下，水稻根中的積累水平不同；低銨鹽濃度下，3個轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的單突變體均不影響水稻生長和氮素積累，amt1.1：1.2雙突變體的生物量和氮含量降低30%，amt1.2：1.3雙突變體生長情況未受影響，而三突變體地上部生長受到抑制，氮素積累下降72%；高濃度銨鹽或者硝酸鹽處理時各種突變體的生物量和氮積累量幾乎不受影響，且三突變體在不施氮肥的田間處理中產(chǎn)量、生物量和氮素積累量均下降[36].

有關(guān)氮高效基因的研究在水稻中報道較多，目前已克隆并驗證了多個水稻氮高效基因，如：NRT1.1B、NR2和OsNPF4.5參與水稻硝酸鹽吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)正向調(diào)控[29，37-38]；攜帶DEP1-1的水稻表現(xiàn)氮響應(yīng)不敏感性營養(yǎng)生長，以增加氮吸收和同化作用[39]；NR2[37]、NAC42-NPF6.1[26]和NGR5[40]則分別參與調(diào)控水稻分蘗(穗數(shù))響應(yīng)氮利用效率；GRF4[41]調(diào)控水稻氮代謝及同化基因的表達(dá)；Nhd1[42]控制氮同化的負(fù)調(diào)控通路，受谷氨酰胺含量正反饋調(diào)節(jié)，其表達(dá)量下調(diào)OsFd-GOGAT的表達(dá)和活性，敲除Nhd1則會使低氮水平的NUE提高；ARE1[43]、OsNLP4[44]、OsNAR2.1和OsNRT2.1a共同過表達(dá)[45-46]；AtAMT1.3[47]可以調(diào)控水稻根系吸收不同形態(tài)氮素，影響產(chǎn)量和氮素利用效率.有關(guān)硝酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因在玉米[48]、大麥[49]、谷子[50]和茶樹[51]的克隆及功能研究均有報道.

2.2 其他氮高效基因功能分析

3 氮高效利用分子生物學(xué)技術(shù)在甘薯上的研究展望

目前,利用現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)如何實現(xiàn)作物的減肥增效是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上的難題.甘薯是塊根類作物，其光合產(chǎn)物直接由源器官運(yùn)輸?shù)綁K根，氮肥過量會使藤蔓旺長，源庫關(guān)系失衡，造成減產(chǎn)，影響經(jīng)濟(jì)效益；氮素缺乏也會造成光合產(chǎn)物供應(yīng)不足而減產(chǎn).因此，提高甘薯氮素利用效率，保障甘薯經(jīng)濟(jì)學(xué)產(chǎn)量的首要手段是培育氮高效品種，發(fā)揮作物本身潛力.

盡管氮高效基因在水稻、小麥和玉米中的研究報道已經(jīng)很多，但在甘薯中卻未有報道，有關(guān)提高NUE的方法多集中在栽培生理方向，例如：氮肥施用量[58]、分期運(yùn)籌[59]等對甘薯源庫關(guān)系產(chǎn)量、品質(zhì)和NUE的影響；在甘薯生長前期，調(diào)控硝態(tài)氮和銨態(tài)氮配施比例可以顯著提高氮積累量、酶活性和調(diào)控基因表達(dá)量[60]；大田作業(yè)中，減氮會顯著降低整個生育期內(nèi)甘薯光合效率，不利于產(chǎn)量的形成[61].相比傳統(tǒng)的QTL連鎖分析，GWAS技術(shù)的成熟為分子育種帶來了巨大便利，結(jié)果也更加準(zhǔn)確和高效，可將其應(yīng)用于甘薯氮高效基因研究中，填補(bǔ)甘薯氮養(yǎng)分利用分子研究上的空白.目前，甘薯的基因組測序已基本完成，可結(jié)合全基因組分析和多種組學(xué)分析，對甘薯群體進(jìn)行遺傳多樣性調(diào)查，挖掘遺傳群體中氮效率性狀的優(yōu)異等位變異并進(jìn)行功能驗證，解析該候選基因在甘薯氮信號傳導(dǎo)通路中的作用機(jī)制；利用基因工程技術(shù)調(diào)控靶位點來提高NUE[62]，為甘薯抗性育種和低氮高產(chǎn)栽培提供支持.