飲片提取和配方顆粒調配的仲歸顆粒中京尼平苷酸和阿魏酸含量差異研究*

鄧杏好，湯鉅添，程潔芳，姚遠華

（1.佛山市順德區第三人民醫院（佛山市順德區北滘醫院），廣東佛山 528311；2.廣東省第二中醫院（廣東省中醫藥工程技術研究院），廣東廣州 510095）

仲歸顆粒來自筆者所在單位臨床驗方經現代化制劑工藝制備而得，該制劑由杜仲、當歸、黃芪等藥味經水提后制粒而成，其用于高血壓防治或使用降壓藥后的輔助治療，通過調節腎功能和血管內皮細胞緊張度等方法，促進患者血壓下降。仲歸顆粒含有多種化學成分[1-4]，經檢索文獻和課題相關研究表明，方中所含京尼平苷酸、阿魏酸具有較為顯著的iNOS-mRNA 調控活性[5-6]，能夠較好地實現前述功效。因此，可以使用上述成分作為評價仲歸顆粒質量和功效等關鍵參數的指標。

中藥配方顆粒為中藥飲片經現代化、規范化技術提取制備的現代化中藥制劑，具有制備工藝先進、質量穩定、提取效率高、使用和攜帶方便等優勢，在多個醫療機構的藥學部門均有較為廣泛的應用[7-8]。但目前為止，使用配方顆粒直接混合調配和全方飲片煎煮后制粒所得的仲歸顆粒是否存在差異，并未進行明確的研究[9-10]。本文擬從兩種方法制備的該制劑中京尼平苷酸和阿魏酸的含量著手，基于含量測定結果，研究上述工藝所得成品是否存在明顯差異，并根據結果，結合效率、性價比等因素，評價其各自的特點和優劣。

1 儀器、試劑和材料

1.1 儀器設備 含量測定使用Waters2695e 高效液相色譜儀，購自美國Waters 公司，配置為光電二極管陣列（PAD）檢測器，柱溫箱，自動進樣器；對照品、樣品稱量使用電子精密分析天平購自瑞士Mettler-Toledo 公司；供試品制備用QS-3000 數顯溫控超聲清洗儀購自昆山超聲儀器廠。

1.2 試劑、試藥和材料 阿魏酸（批號：110773-201915）和京尼平苷酸對照品（批號：111828-201805）購自中國食品藥品檢定研究院。色譜分析用甲醇、乙腈、磷酸購自德國Sigma-Alderich 公司，試驗用超純水購自Watsons；水煎液制粒法使用的各藥味飲片購自廣東康美藥業股份有限公司；配方顆粒調配法使用的各藥味配方顆粒購自廣東一方制藥股份有限公司。

2 方法和結果

2.1 樣品制備 取處方量杜仲、當歸、黃芪等仲歸顆粒各藥味飲片，加30 倍量水提取兩次，每次60min，所得煎液合并、濾過，濃縮成稠膏后，加淀粉、糊精等輔料制粒，即得飲片水煎液配制的仲歸顆粒；另取同生藥量的配方顆粒，過篩混勻，即得配方顆粒調配的仲歸顆粒。精密稱取上述兩種顆粒各約2g，轉移至25mL量瓶中，加50%甲醇振搖溶解，繼續加入該溶劑定容至刻度，密塞，所得溶液超聲處理30min，取出放冷后，加50%甲醇定容至刻度，再使用0.45μm 微孔濾膜濾過，取續濾液作為供試品溶液。

2.2 對照品溶液制備 取京尼平苷酸和阿魏酸對照品，各精密稱取約5mg，分別轉移至5mL 量瓶中，加甲醇溶解后定容至刻度，即得兩種對照品含量均為1mg/mL的對照品溶液。

2.3 樣品測定方法 參考文獻方法并進行適當修改[10]，吸取供試品和對照品溶液，使用色譜柱為Waters XDB C18（柱長250mm，直徑4.6mm，粒徑5μm），流動相使用乙腈（A）-0.1%磷酸（B），使用梯度洗脫，程序為：0～10min，10%-15%A；10～20min，15%-50%A；20～25min，50%-90%A；25～30min，90%-10%A；后運行10min；流速1.0mL/min，檢測波長238nm（0～10min）、316nm（10～30min），柱溫25℃，進樣量10μL。記錄所得色譜圖，以及京尼平苷酸和阿魏酸的峰面積，對照品和供試品色譜圖見圖1。

圖1 對照品和供試溶液色譜圖（對照品溶液中京尼平苷酸和阿魏酸濃度均為100μg/mL）

2.4 樣品測定方法學考察

2.4.1 標準曲線和線性 精密吸取京尼平苷酸和阿魏酸對照品溶液，分別吸取1mL，轉移至同一5mL量瓶中，混勻后加甲醇定容至刻度，得兩種成分濃度均為200μg/mL 的混合對照品溶液；取上述溶液，逐級稀釋，分別制得京尼平苷酸和阿魏酸濃度均為100、50、20、10、5μg/mL 的溶液。吸取上述溶液，使用“2.3”所述HPLC 方法測定京尼平苷酸和阿魏酸峰面積，以該值為縱坐標，濃度為橫坐標，進行線性回歸，結果得京尼平苷酸的回歸方程為y=7066.1x-4119.3（r2=0.9998），阿魏酸的回歸方程為y=14287x+26741（r2=0.9991）。上述結果表明，方法線性良好，能夠在5～200μg/mL濃度范圍內對京尼平苷酸和阿魏酸進行準確測定。

2.4.2 精密度考察 使用飲片煎液配制的仲歸顆粒所制備的供試品溶液（下同），使用“2.3”所述HPLC方法連續測定6次，記錄京尼平苷酸和阿魏酸峰面積，計算峰面積的RSD。結果顯示，阿魏酸峰面積的RSD 為0.36%，京尼平苷酸為1.32%；經檢索2020 年版《中國藥典》，上述數值符合規定，表明方法精密度良好。

2.4.3 重復性考察 按“2.1”所述方法平行制備6份仲歸顆粒供試品溶液，使用“2.3”所述HPLC 方法測定，記錄京尼平苷酸和阿魏酸峰面積，計算各自含量及其RSD。結果顯示，京尼平苷酸為1.37%，阿魏酸含量的RSD 為0.38%；經檢索2020年版《中國藥典》，上述數值符合規定，表明方法重復性良好。

2.4.4 穩定性考察 將供試品溶液放置在自動進樣器中，分別在放入后0、2、4、6、8、12h 使用“2.3”所述HPLC 方法測定，記錄京尼平苷酸和阿魏酸峰面積，計算各自含量及其RSD。結果顯示，京尼平苷酸含量的RSD 為2.36%，阿魏酸為0.20%；經檢索2020 年版《中國藥典》，上述數值符合規定，表明方法所制備樣品在12h內穩定性良好。

2.4.5 回收率測定 取仲歸顆粒1g，置于25mL 兩瓶中，精密加入對照品溶液適量（加入濃度見表1、表2），繼續按“2.1”所述方法制備供試品溶液，再使用“2.3”所述HPLC 方法測定，記錄京尼平苷酸和阿魏酸峰面積，計算各自含量、回收率及其RSD。結果顯示，京尼平苷酸的平均回收率為99.41%，回收率的RSD 為3.43%；阿魏酸的平均回收率為98.26%，回收率的RSD 為3.22%；經檢索2020 年版《中國藥典》，上述數值符合規定，表明方法準確度良好。

表1 京尼平苷酸回收率測定結果（n=3）

2.5 兩方法樣品測定 按“2.1”項下方法分別制備和調配仲歸顆粒樣品各10 批（詳見表3），按“2.3”所述HPLC 方法測定，記錄京尼平苷酸和阿魏酸峰面積，計算各自含量。結果顯示，10 批飲片煎液制備的仲歸顆粒中，京尼平苷酸的含量為0.1758～0.1942mg/g，阿魏酸的含量為0.4036～0.4987mg/g；10批配方顆粒調配的仲歸顆粒中，上述兩種成分的含量分別為0.1383～0.1894mg/g 和0.3126～0.4650mg/g。

表3 飲片煎液配制和配方顆粒調配的仲歸顆粒京尼平苷酸和阿魏酸含量測定結果

2.6 數據處理和統計分析 根據“1.4”項下所得含量測定結果，計算兩種方法制備的仲歸顆粒的含量，將所得含量數據導入SPSS 24.0 軟件中，數據呈現形式為平均值±標準差；對兩組數據進行Student-T檢驗，分別比較各組樣品中阿魏酸與京尼平苷酸含量總和的差異；同時，對兩個指標性成分也分別進行Student-T 檢驗，研究單成分組與組之間差異。對兩種方法制備的10 批樣品進行Student-T檢驗結果顯示，飲片煎液配制法和配方顆粒調配法所得樣品中，以每一批樣品阿魏酸和京尼平苷酸含量總和計，兩種方法所得結果無顯著性差異（P＞0.05）；但對兩種成分分開檢驗的結果則顯示，兩種方法所得樣品中阿魏酸和京尼平苷酸的含量均存在顯著性差異（P＜0.05）。

3 討論

根據含量測定結果，可知兩種方法制備樣品中目標成分的含量無明顯差異，但飲片混合煎煮法所得顆粒含量相對較為接近。由“2.2”項下結果可知，單成分比較時，兩種方法存在組間顯著性差異。其可能的原因是當使用兩種指標性成分的加和值進行統計分析時，由于數值增大，數值差異所占比例減小，因此導致T 檢驗無法得出顯著性差異的結果；而當分開計算時，數值相對較小，各組對應樣品間差異值占比增加，因此能夠發現顯著性差異。綜合上述結果，可知兩種制備方法導致指標性成分差異明顯的原因，可能是直接使用配方顆粒混合，所得樣品經篩分后不同程度存在損失的情況。同時混合過程中顆粒難以攪拌均勻，導致各批次樣品差異較大[7-8]。上述情況在未開發仲歸顆粒，該方以配方顆粒配制時也存在。由于調配后由患者自行沖服，受其依從性和相關操作影響，仲歸顆粒調配和使用的穩定性、均一性更無法保證。由于使用飲片同時煎煮提取后再將浸膏制粒時，各藥味中的活性成分均溶于統一分散系統中，在轉移、合并、濃縮過程中，上述成分不易丟失，因此均一性和穩定性較好[9]。

綜上所述，雖然從成本和含量等方面分析，配方顆粒直接混合調配仲歸顆粒時，與飲片水提液制粒主要指標性成分濃度范圍接近，且前者方法更為簡便，但從成品質量穩定性的角度考慮，后者仍較為適宜。上述研究結果，除為仲歸顆粒的制備工藝提供了科學依據外，進一步證明了該制劑的開發和制備價值。