自發性高血壓大鼠年齡相關性左心室肥厚的動態變化

易達松，袁善斌，曾俊義，趙健清，丁 露，文 通，聶俊剛

(南昌大學第一附屬醫院 1.心血管內科； 2.江西省高血壓病研究所，江西 南昌 330006；3.江西省信豐縣人民醫院 重癥醫學科，江西 信豐 341600)

高血壓是常見病，也是心腦血管病最主要的危險因素。報告顯示，中國高血壓患者已達2.45億，每年逾200萬人死亡與高血壓相關[1]。高血壓可導致左室肥厚，繼而引起心律失常、心力衰竭和猝死等并發癥[2-3]。探索高血壓左室肥厚發生機制并尋找其診療新方法成為高血壓防治的重要舉措。

自發性高血壓大鼠(spontaneously hypertensive rats，SHR)是高血壓研究較為理想的實驗動物模型，廣泛應用于高血壓左室肥厚相關研究[4-5]。對于SHR病理生理的實驗研究，評價其病理生理狀態是實驗成功的前提。SHR受飼養環境及代際遺傳變異等因素的影響，其病理生理特征可能存在一定差異[6-7]。本研究擬對SHR左室肥厚與血壓的動態關系進行動態。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物：4周齡SPF級雄性SHR 45只、京都種Wistar大鼠(Wistar Kyoto rats，WKY)35只[北京維通利華實驗動物技術有限公司，許可證號：SCXK(京)2016-0006]，24 h自由飲水和進食，隨機分籠飼養42周，于6、8、12、18、24、32和42周共7個時點觀測大鼠相關指標。

1.1.2 主要試劑：HE染色劑盒(北京索萊寶科技有限公司)，Trizol Universal Reagent、FastQuant RT Kit、SuperReal PreMix Plus(北京天根生化科技有限公司)；大鼠ANP、β-MHC和GAPDH引物(深圳華大基因股份有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 血壓測量：用北京軟隆生物技術有限公司大小鼠智能無創血壓計BP-2010A對不同周齡大鼠釆用尾套法測量清醒狀態下收縮壓[8]。重復測量5次，每次間隔1 min，去除最大和最小值，取余下3次測量數據均值。

1.2.2 心臟結構及功能監測：采用超高分辨率小動物超聲成像系統檢測左心室射血分數(left ventri-cular ejection fraction,LVEF)、舒張期室間隔厚度(interventricular septal thickness at diastole，IVST)及左心室舒張期末后壁厚度(left ventricular posterior wall thickness at end diastole，LVPWT)，分別記錄5個心動周期，取各參數平均值[9]。

1.2.3 HE檢測心肌組織病理形態：腹腔注射10%水合氯醛0.3 mL/100 g體質量麻醉大鼠，迅速取出心臟,清除心房及右心室游離壁，稱重并計算左室質量指數(left ventricular mass index,LVMI)；取7個時點的大鼠左心室組織進行HE染色，測量心肌細胞橫徑(transverse diameter of myocardial cell,TDM)。顯微鏡下觀察切片并拍照，Image J軟件分析處理圖片，選擇3個高倍視野，再隨機選取3個心肌細胞橫切面，測量其橫徑，取平均值。

1.2.4 RT-qPCR檢測心肌細胞肥大基因ANP和β-MHC：按試劑說明書依次進行總RNA提取、反轉錄及qPCR反應。ANP上游引物5′-GGGGGTAG GATTGACAGGAT-3′，下游引物5′-CTCCAGGAGGG TATTCACCA-3′；β-MHC上游引物5′-CCTCGCA ATATCAAGGGAAA-3′，下游引物5′-TACAGGTGCA TCAGCTCCAG-3′；GAPDH上游引物5′-CAAGTTC AACGGCACAGTCAAG-3′，下游引物5′-ACATACTC AGCACCAGCATCAC-3′。內參為GAPDH，用2-△△Ct計算心肌細胞肥大基因相對表達量。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 大鼠收縮壓的動態變化

6至12周SHR收縮壓快速上升，12周時較WKY大鼠顯著升高(P<0.05)，隨后SHR血壓呈小幅緩慢上升并維持高位，且與WKY大鼠血壓差距持續存在(表1)。

表1 大鼠收縮壓動態變化

2.2 心臟結構及功能的動態變化

6周時兩組大鼠IVST和LVPWT均相近；12周至32周SHR組IVST較WKY組顯著增加且差異持續增大(P<0.05)，32周后兩組間IVST差異逐漸回落但仍有顯著差異(P<0.05)；8至32周SHR組LVPWT較WKY組明顯增加且差異持續增大(P<0.05)，同樣32周后兩組間LVPWT差異有所減小但仍差異明顯(P<0.05)(表2)。

2.3 左心室組織病理形態的改變

SHR組LVMI呈先降后升變化，除8周外，同周齡SHR均顯著高于WKY大鼠。6周時兩組大鼠TDM相近，8至32周SHR組TDM較WKY組顯著增加且差異持續擴大(P<0.05)，32周后差異逐漸縮小但仍存顯著差異(P<0.05)(表3，圖1)。

2.4 心肌肥厚相關基因ANP和β-MHC表達的變化

6周時ANP表達相近，8周時SHR較WKY大鼠的表達上調(P<0.05)，12周時表達差異縮小，至18周時兩組ANP表達出現反轉但無顯著差異，24周時兩組大鼠ANP表達再次反轉，SHR較WKY大鼠表達上調(P<0.05)，此后兩組間ANP表達差異逐步增大，42周時SHR較WKY大鼠顯著上調(P<0.05)(圖2)。

表2 大鼠心臟結構和功能的動態變化

表3 大鼠左室病理形態的動態變化

A1.SHR at 6 weeks; B1.SHR at 18 weeks; C1.SHR at 32 weeks; A2.WKY at 6 weeks; B2.WKY at 18 weeks;C2.WKY at 32 weeks

*P<0.05 compared with WKY圖2 大鼠左心室組織ANP基因的動態表達Fig 2 Dynamic expression of ANP in left ventricular myocardium of n=5-6)

6周時β-MHC表達相近，8至12周SHR較WKY大鼠明顯上調并持續擴大(P<0.05)，12周后兩組大鼠β-MHC表達差異持續存在(圖3)。

3 討論

本研究顯示， 伴隨早期血壓快速上升并持續高位波動，心臟后負荷進行性增加，SHR左室出現動態肥厚改變，相關肥厚性指標IVST、LVPWT和LVMI均呈現適應性動態變化。32周后SHR肥厚指標IVST及LVPWT均有所回落，而LVMI從12周開始持續增加至42周，推測與SHR左室肥厚由向心性向離心性轉變相關。有報道顯示，伴隨SHR鼠齡增加，左室肥厚發展至一定階段可出現萎縮性改變[10-11]。此外，6周時LVMI均處于兩組大鼠的高點，推測生長發育期大鼠體質量增長快于左心室質量增加[12]。縱觀SHR血壓與左室肥厚動態演變，其心臟結構變化略微遲滯于血壓改變，符合高血壓左室肥厚宏觀變化過程。

*P<0.05 compared with WKY圖3 大鼠左心室組織β-MHC基因的動態表達Fig 3 Expression of β-MHC in left ventricular myocardium of rats n=5-6)

HE染色顯示SHR組TDM與IVST及LVPWT變化趨勢一致，再次驗證SHR左室肥厚變化中向心性與離心性肥厚的轉變。SHR左室心肌ANP表達呈先升后降再升趨勢，早期伴隨血壓急劇上升，ANP表達上調，待血壓達峰值并穩定后表達回落，當左室向離心性肥厚轉變時表達再次上調。ANP是心臟的自分泌抗肥厚因子，其表達水平因心肌肥厚狀態而變化[13]。SHR左室心肌β-MHC表達呈先升后降變化，提示SHR左室肥厚隨血壓升高經歷早期快速發展后持續維持肥厚狀態，與SHR左室肥厚相關研究相符[14-15]。由此可見，伴隨SHR左室肥厚微觀形態的改變，肥厚相關基因表達也呈現出與之相應的動態變化。

通過對SHR中長期的連續觀測，證實伴隨SHR的血壓改變其左室肥厚不斷發展，從結構到功能均呈現出特征性動態改變，可為高血壓左室肥厚相關研究提供有益參考。