黑沙蒿黃酮抗氧化性能的構效關系分析

楊怡萌, 黎 可, 姜顯瓊, 陳聰梅, 王 強*

(1. 重慶第二師范學院 生物與化學工程學院, 重慶 400067; 2. 重慶第二師范學院 脂質資源與兒童日化品協同創新中心, 重慶 400067;3. 國家超級計算深圳中心, 深圳 518055)

黑沙蒿為菊科植物,全草均可入藥[1],具有抗氧化、降血糖、降膽固醇、消炎止血等藥用功效[2].黑沙蒿主要含有多糖類、黃酮類、揮發油類和三萜類物質,其中黃酮類化合物是發揮抗氧化作用的主要活性成分[3].現有文獻表明,黃酮類化合物的抗氧化作用主要通過氫轉移機制得以實現[4-7],即黃酮化合物中的酚羥基與自由基發生抽氫反應生成較穩定的半醌式自由基,從而終止自由基鏈式反應,起到抗氧化的作用.然而,由于自由基作為高活性中間體在實驗過程中很難捕捉,使得單一通過實驗手段進行抗氧化機理的深入研究受到了限制.換句話說,從分子水平對黑沙蒿黃酮類化合物通過清除自由基發揮抗氧化活性的作用機制仍然有待進一步研究.

近年來,實驗工作者采用不同的實驗手段對黑沙蒿等黃酮類化合物的自由基清除活性進行探索研究,如DPPH(1,1-二苯基-2-三硝基苯肼)自由基清除活性測定法[8]、ATBS測定法[9]以及羥基/超氧陰離子自由基清除法[10-11]等.王勇等[12]以IC50值作為評價指標,采用分光光度法研究了黑沙蒿中黃酮類化合物清除·OH自由基的活性,并初步探討了黑沙蒿黃酮清除羥基自由基活性與結構之間的關系.Asres等[13]通過縱向對比不同類別的黃酮類化合物結構及DPPH自由基清除活性,發現黃酮化合物的分子結構直接決定了抗氧化活性的高低.不難看出,黃酮的分子結構與其抗氧化性能之間具有明顯的相關性,但是,單一的實驗研究中多數缺乏定量的理論解釋來具體闡明結構與活性之間的關系以及抗氧化活性的內在規律.

量子化學計算的快速發展為深入探索黑沙蒿黃酮抗氧化活性構效關系提供了便捷,例如,齊婧敏等[14]基于密度泛函理論,采用B3LYP方法對黑沙蒿黃酮化合物進行氣相優化,并對其抗氧化作用進行了分析.注意到B3LYP方法的經典毋庸置疑,然而近年的研究中,科研工作者發現其計算精確度不夠理想[15-16],而M06-2X[17-18]密度泛函方法在黃酮類化合物的自由基清除活性計算中備受好評,例如Li等[19]運用密度泛函M06-2X方法對比分析了13種黃酮化合物結構與抗氧化活性的關系,通過羥基O—H鍵解離能的計算揭示了氫轉移機制是黃酮發揮抗氧化作用的優勢路徑,并且計算值與實驗值保持較高的一致性.

實驗及量子化學計算的方法在黃酮類化合物抗氧化活性的研究中發揮著同樣重要的作用,考慮到不同計算方法的差異性以及溶劑化效應的影響,本文運用M06-2X密度泛函方法進行溶劑相優化,對4種黑沙蒿黃酮的抗氧化活性進行深入分析,在優化結構分析、抽氫反應的熱力學能量分析、NBO電荷分析的基礎之上,本文首次采用Multiwfn軟件[20]對黑沙蒿黃酮的自由基穩定性進行評價,通過自旋密度圖和酚羥基氧原子上的自旋密度值形象化對調控黃酮自由基穩定性的因素進行闡釋.最后,針對不同溶劑的極性對黑沙蒿黃酮抗氧化性能的影響也進行了探索分析.希望通過本文的研究,提出調控黑沙蒿黃酮抗氧化性能的關鍵活性位點及分子結構-抗氧化性能關系的內在規律,同時為量子化學計算在天然黃酮抗氧化活性的構效關系的探索中提供新的分析角度和思路,為天然黃酮抗氧化性能的深入研究與應用提供理論依據.

1 計算方法

本文中所有的密度泛函計算結果都是在Gaussian 09上運行[21],考慮到M06-2X方法在計算分子弱相互作用時精密度更高[22],以及近年來在黃酮化合物計算中被廣泛應用,因此針對4種黑沙蒿黃酮,采用M06-2X方法在全電子基組6-31G(d)水平下,以SMD[23]為溶劑模型,以甲醇為溶劑進行結構優化,頻率的計算用于確定虛頻的數量,中間體的虛頻數為0.文中各物質的熱力學能量描述用焓值表示.

基于黑沙蒿黃酮分子的優化結構計算模擬,本文通過幾何構型參數分析、抽氫反應熱力學能量分析、NBO電荷分析、黃酮自由基穩定性分析對黑沙蒿黃酮抗氧化活性的構效關系進行探究,并針對不同的溶劑(水、甲醇、乙醇)極性對黑沙蒿抗氧化活性的影響也進行了對比分析,深入探討黑沙蒿黃酮抗氧化活性的構效關系及內在規律.其中,黃酮半醌式自由基的自旋密度圖是在Multiwfn軟件[20]下得到的.

2 結果與討論

2.1 優化結構參數分析現有文獻表明,黑沙蒿黃酮種類較多[3,24-25],本文選擇4種具有代表性的黃酮分子(芫花素、羥基芫花素、芹菜素-7,4′-二甲醚、鼠李素),其分子結構如圖1所示,其中,黃酮ABC環對應的位置如圖1(a)所示.

根據黃酮類化合物的抗氧化作用機制,抗氧化性能的高低由酚羥基的O—H鍵斷裂發生抽氫的難易程度來決定,因此,酚羥基的O—H鍵長是評價其抗氧化活性的關鍵結構因素,4種不同黑沙蒿黃酮的優化結構如圖2所示,優化結構參數如表1所示.

圖2 黑沙蒿黃酮化合物的優化結構示意圖

表1 4種黑沙蒿黃酮化合物的酚羥基O—H鍵鍵長及∠C—O—H鍵角

分析不同黑沙蒿黃酮分子的酚羥基O—H鍵,從表1中可以發現,不同黃酮分子的酚羥基O—H鍵長相差不大,主要分布在0.096 7～0.098 3 nm之間.其中,鼠李素C3上的O—H鍵最長(0.098 3 nm),再橫向對比C4′、C5、C3′位點酚羥基O—H鍵長與其他4種黃酮化合物相差不大,另外,考慮到鼠李素的羥基數最多,初步推測鼠李素的抗氧化活性較高.以同樣的思路,不難發現,羥基芫花素具有3個酚羥基活位點,且C3′羥基的鍵長與芫花素和芹菜素-7,4′-二甲醚中任意鍵長相比更長(0.097 1 nm對0.096 8 nm),因此,根據酚羥基O—H鍵長的數據對比,初步認為4種黑沙蒿黃酮的抗氧化活性高低依次為:鼠李素>羥基芫花素>芫花素>芹菜素-7,4′-二甲醚.

再次對比不同黑沙蒿黃酮分子的酚羥基C—O—H鍵角(表1),發現大多數的鍵角是介于108°～110°范圍內,其中鼠李素C3—O—H的鍵角(103.4°)及羥基芫花素、鼠李素的C3′—O—H鍵角(約107°)相對較小,分析可能是由于鼠李素C3位點羥基中的氫原子與相鄰羰基中電負性較大的氧原子形成了弱的氫鍵作用(如圖2虛線所示)造成的.同樣地,鼠李素和羥基芫花素C3′的羥基與C4′羥基中的氧原子也可以通過形成分子內氫鍵,使得C3′位點的O—H鍵被有所拉長,C3′—O—H鍵角有所壓縮.

2.2 抽氫反應的熱力學能量分析根據黃酮類化合物抗氧化作用機制,抽氫反應的難易程度還可以從熱力學角度進行分析,以實驗測定常用的DPPH自由基為捕獲對象,對4種黃酮分子(Fl—OH)與DPPH·在甲醇溶劑下發生抽氫反應[21-23](Fl—OH+DPPH·=Fl—O·+DPPH2)的反應焓變進行計算分析,結果如表2所示.可以看出,抽氫反應為吸熱過程,因此,該過程所需能量越低,代表反應越容易發生,自由基清除活性越高.

從表2中數據可以得出以下結論:1) B環鄰位雙羥基的存在對抗氧化性能的提升影響顯著.通過對比4種黑沙蒿黃酮,發現鼠李素、羥基芫花素均含有3′,4′-雙羥基結構,當C4′位點H原子解離后,自由基氧原子具有較高的電負性,與相鄰羥基中的H原子可以形成分子內氫鍵,大大增加了產物自由基的穩定性,使得鼠李素和羥基芫花素的C4′位點抽氫反應焓較低(66.18和73.80 kJ/mol);另一方面,對于失去鄰位雙羥基結構的芫花素而言,其C4′位點的抽氫反應焓明顯增高(106.32 kJ/mol),進一步驗證了上述結論.2) B環羥基位點抗氧化活性最高,A環活性最低.4種黑沙蒿黃酮在A環上的C5—OH的抽氫反應焓最高(>104 kJ/mol),抗氧化活性最低,而B環中C4′—OH是鼠李素、羥基芫花素、芫花素的最高活性位點.3) 通過羥基位置和數量的綜合考慮,根據4種黑沙蒿黃酮抽氫反應焓值的對比分析,得出其活性次序為:鼠李素>羥基芫花素>芫花素>芹菜素-7,4′-二甲醚.這一結論與上文結構參數的結論保持一致,并與齊婧敏等[14]提出的抗氧化活性次序也保持一致.

表2 在甲醇溶劑中4種黑沙蒿黃酮不同羥基位點的抽氫反應焓的計算值

2.3 NBO電荷分析基于熱力學能量分析,得出了4種黑沙蒿黃酮抗氧化性能的高低,為了從電子效應分析其內在成因,對黃酮酚羥基H原子的NBO電荷進行了對比,發現黃酮發揮抗氧化性能是通過對自由基的捕獲,而這一過程是具有較高的電負性的原子通過與黃酮酚羥基的H原子結合而實現,因此,黑沙蒿黃酮酚羥基H原子的NBO電荷高低是決定其抗氧化活性差異的內在因素.由于自由基的作用位點氧或氮原子呈電負性,黃酮類化合物中酚羥基上的H原子所帶正電荷越多(即NBO電荷越高)時,越容易與該類自由基發生結合,它的抗氧化性能越強.于此,運用優化后的分子在M06-2X/6-31G(d)方法下進行單點計算,得到4種黑沙蒿黃酮酚羥基H原子上的NBO電荷分布,如表3所示.

根據表3的數據分析,發現表2中抽氫反應能量越低的羥基位點,H原子的NBO電荷更高.即黑沙蒿黃酮酚羥基上H原子的NBO電荷與抽氫反應焓的高低成反比關系.比如在羥基芫花素中,氫原子的NBO電荷表現為C4′(0.511 4)>C3′(0.509 1)>C5(0.492 2),代表其抽氫反應的活性高低是C4′>C3′>C5,與熱力學能量分析結論(73.80比90.29比109.72 kJ/mol)保持一致.同樣的,芫花素、芹菜素-7,4′-二甲醚的H原子NBO電荷也與抽氫反應能量的高低成反比關系,芫花素抽氫反應焓值C5位點(110.34 kJ/mol)>C4′位點(106.32 kJ/mol),NBO電荷分布為C5(0.492 2)

表3 4種黑沙蒿黃酮酚羥基H原子上的NBO電荷分布

然而,值得注意的是,在鼠李素中,NBO電荷數最大的是C3號位羥基H原子,與抽氫反應能量最低位點C4′這一結論有所出入,分析原因可能與該位置酚羥基上的H易與鄰位的羰基形成分子內氫鍵,從而使負電荷更多地向羰基離域,使得C3—OH中氫原子的NBO電荷有所升高;另一方面,C3—OH在發生O—H鍵斷裂之后,其半醌式自由基失去了氫鍵的穩定化作用,使得其從熱力學角度上有所升高,而C4′位點在發生O—H鍵斷裂后,其鄰位C3′—OH的分子內氫鍵依然存在,使得C4′位點的半醌式自由基穩定性依然較高,鼠李素最高活性位點的最終提出將結合黑沙蒿黃酮自由基的自旋密度分布情況在下文進行分析.

此外,還發現不同的黑沙蒿黃酮中均表現出B環上羥基活性較高,A環C5—OH活性最低(約0.49),與上文抽氫反應焓的結論保持一致,造成這一結果的原因可能是黑沙蒿黃酮分子中C環均含有不飽和羰基,它的存在一方面增強了B環的共軛作用,另一方面由于不飽和羰基的吸電子特性鈍化了A環上的羥基活性,而對B環的鈍化作用則不明顯.

2.4 自旋密度分析黃酮類化合物自由基清除活性不僅取決于黃酮分子中羥基位點的給氫難易程度,更取決于產物黃酮自由基的穩定性,單電子自旋密度分布是評價自由基穩定性的重要指標.基于黑沙蒿黃酮分子優化結構的單點計算,運用Multiwfn軟件[20]得到了4種黑沙蒿黃酮自由基的自旋密度分布圖.圖3顯示了自由基結構中單電子的分布情況,而每一個原子上所標出的數值,是對應自旋密度大小(Alpha電子密度-Beta電子密度).

為了清晰可見,以鼠李素為例,對比了不同羥基位點發生抽氫反應后半醌式自由基的自旋密度圖,如圖3所示.根據上文鼠李素的抽氫反應焓值和不同羥基H原子的電荷分布,發現C4′—OH相對于C3—OH位點表現出略低的反應焓(66.18比70.83 kJ/mol),但NBO電荷分析中卻表現出C3—OH位點的氫原子的電荷更正(0.510 0比0.523 5),這一矛盾促使對鼠李素這2個位點的半醌式自由基的穩定性差異先進行剖析.通過自旋密度圖發現,鼠李素—C4′—自由基(圖3(b))和鼠李素—C3—自由基(圖3(c))中單電子在B和C環均有離域,但是前者的離域程度更高,這一結論可以從羥基氧原子的自旋密度值得以驗證;從鼠李素C4′—OH上的氫發生解離后,自旋密度遠遠小于C3—OH上氧原子的自旋密度值(0.290比0.313),說明鼠李素—C4′—自由基單電子更多地從氧原子上離域到了相鄰原子上,使得自旋密度分布更加分散,自由基穩定性更高.分析其內在成因,可能是鼠李素C4′—OH在抽氫之后,與相鄰的C3′形成的分子內氫鍵的穩定化作用造成的.因此,認為鼠李素的最高活性位點是C4′—OH,最高活性位點的提出要結合熱力學分析以及自由基產物的穩定性進行綜合評判.

圖3 鼠李素半醌式自由基的自旋密度分布圖

此外,還發現鼠李素4個不同羥基位點自由基中酚羥基氧原子的自旋密度數值高低次序為;C4′(0.290)

以同樣的研究思路,分別提出了其他3種黑沙蒿黃酮的最高活性位點,如圖4所示.為了清晰可見,將4種黑沙蒿黃酮的最高活性位點的自旋密度圖進行對比分析,結果發現,4種黑沙蒿黃酮最高活性位點對應的自由基氧原子的自旋密度從低到高分別為;鼠李素C4′位點0.290(圖3(b))、羥基芫花素C4′位點0.304(圖4(a))、芫花素C4′位點0.337(圖4(b))、芹菜素-7,4′-二甲醚C5位點0.564(圖4(c)),該數值越低,即單電子離域越明顯,半醌式自由基穩定性越強,抗氧化活性越高,換句話說,黑沙蒿黃酮自由基氧原子的自旋密度分布與抗氧化性能成反比關系.

圖4 最高活性位點半醌式自由基自旋密度分布圖

此外,不難發現該趨勢與上文通過結構參數和熱力學能量分析提出的4種不同黑沙蒿活性位點的高低次序保持一致,即鼠李素>羥基芫花素>芫花素>芹菜素-7,4′-二甲醚,同樣含有分子內氫鍵的鼠李素和羥基芫花素活性較高,說明分子內氫鍵是調控黑沙蒿黃酮自由基穩定性及抗氧化性能的關鍵結構因素,B環4′—OH是黑沙蒿黃酮的關鍵活性位點.

基于自旋密度的對比研究,認為通過自旋密度分布判斷半醌自由基穩定性這一分析角度,單一黃酮分子中最高活性位點的提出以及不同黃酮分子間最高活性位點的縱向對比均具有重要的理論意義,為從分子水平對黃酮類化合物抗氧化活性構效關系的分析提供了新思路.

2.5 溶劑極性對黑沙蒿黃酮抗氧化性能的影響分析為了進一步分析不同溶劑極性對黑沙蒿黃酮抗氧化性能的影響,在水、乙醇兩種溶劑下,同樣運用M06-2X/6-31G(d)方法對黑沙蒿黃酮在與DPPH自由基發生抽氫反應(Fl—OH+DPPH·=Fl—O·+DPPH2)歷程的焓值進行了計算分析,結果如表4所示.為了清晰可見,將甲醇溶劑下的抽氫反應焓(表2)與水、乙醇溶劑下的焓值(表4)進行對比,并繪制成折線圖,不同顏色的曲線代表不同的溶劑下能量數據,如圖5所示.

圖5 不同溶劑下黑沙蒿黃酮的抽氫反應焓值對比圖

水(H2O)、甲醇(MeOH)、乙醇(EtOH)溶劑極性依次降低,根據表4和圖5的對比分析中,可以更加清晰地看出;在3種溶劑中各位點抽氫反應焓值高低次序為,圓形曲線(水)>方形曲線(甲醇)>三角形曲線(乙醇),即隨著溶劑的極性減弱有利于黑沙蒿黃酮抗氧化性能的提升,這一結論與前人采用密度泛函理論研究黃芪黃酮[26]、白藜蘆醇[27]中溶劑極性對抗氧化活性影響的結論保持一致.此外,還發現溶劑化效應的影響并未改變4種黑沙蒿黃酮的抗氧化次序以及最高活性位點的提出.即抗氧化次序依舊是鼠李素>羥基芫花素>芫花素>芹菜素-7,4′-二甲醚,其中B環的C4′位點依然是黑沙蒿黃酮的最高活性位點.

表4 4種黑沙蒿黃酮在不同溶劑下的抽氫反應焓計算值的對比分析

3 結束語

本文基于密度泛函理論,運用M06-2X方法對黑沙蒿黃酮分子進行溶劑相優化計算,從幾何構型參數分析、抽氫反應熱力學能量分析、NBO電荷分析、黃酮自由基穩定性分析等多角度對黑沙蒿黃酮抗氧化性能的構效關系進行探究,并針對不同的溶劑極性對黑沙蒿抗氧化活性的影響也進行了對比分析,得出主要結論如下:

1) 4種黑沙蒿黃酮的抗氧化性能強弱次序為;鼠李素>羥基芫花素>芫花素>芹菜素-7,4′-二甲醚,其中鼠李素和羥基芫花素是主要活性成分.

2) 酚羥基的位置對黑沙蒿黃酮抗氧化性能的影響較為顯著,其中B環C4′—OH位為黑沙蒿黃酮的最高活性位點,當B環上存在鄰位雙羥基時,由于形成分子內氫鍵,使得黃酮分子的抗氧化活性能力顯著增強;A環上的C5位羥基為活性最低位點.

3) 黑沙蒿黃酮不同位點酚羥基上H原子的電荷分布與黑沙蒿黃酮抗氧化活性能力強弱成正比關系,H原子所帶正電荷越高,對自由基的捕捉越容易.

4) 黑沙蒿黃酮不同位點酚羥基上O原子的自旋密度分布與黑沙蒿黃酮抗氧化活性能力強弱成反比關系,單電子離域越明顯,半醌式自由基穩定性越高,抗氧化活性越強.通過自旋密度分布判斷半醌自由基穩定性這一分析角度,單一黃酮分子中最高活性位點的提出以及不同黃酮分子間高活性位點的縱向對比均具有重要的理論意義.

5) 隨著溶劑的極性的減弱,黑沙蒿黃酮的抗氧化活性增強,然而溶劑化效應的影響并不改變4種黑沙蒿黃酮的抗氧化次序以及最高活性位點.

綜上所述,本研究通過量子化學計算的角度對4種黑沙蒿黃酮化合物抗氧化活性的構效關系進行了深入討論,提出影響最高活性位點的內在結構調控因素,并對溶劑極性對抗氧化活性的影響進行對比分析,希望對黑沙蒿黃酮類化合物抗氧化機制的深入理解提供幫助,為天然黃酮類化合物抗氧化活性研究的應用與發展奠定理論基礎.

致謝重慶第二師范學院校級科研一般項目(KY202120C)和國家超級計算深圳中心提供的高斯09計算資源對本文給予了資助和幫助，謹致謝意.