非小細胞肺癌組織中肽基精氨酸脫亞胺酶4、鳥苷酸結合蛋白1表達與患者臨床病理特征的關系研究

宋煒，王佳，王飛娟，馬軍偉

肽基精氨酸脫亞胺酶4（peptidylarginine deiminase 4，PADI4）是一種翻譯后修飾酶，可在鈣離子存在的情況下將精氨酸殘基轉化為瓜氨酸殘基，瓜氨酸化后的蛋白質分子構象常發生改變，從而導致其生化活性改變。PADI4在類風濕關節炎（rheumatoid arthritis，RA）患者血清中含量明顯升高，患者機體產生抗PADI4抗體，且PADI4瓜氨酸化多種蛋白質可引起機體自身的免疫反應，從而參與RA的發生與發展。近年來其他研究表明，PADI4也參與了腫瘤、潰瘍性結腸炎、多發性硬化癥的發?。?-2］。目前已知鳥苷酸結合蛋白1（guanylatebinding protein 1，GBP1）在乳腺癌、結直腸癌等腫瘤中具有抗腫瘤作用，其主要介導干擾素（interferon，IFN）的通路激活，從而促使數量眾多的IFN誘導基因表達，廣泛參與抗腫瘤以及抗病原微生物等過程［3］。GBP1可對蛋白質進行翻譯、修飾，并且已經被證實在胃癌、卵巢癌、肝癌中特異性表達，可參與腫瘤發生、發展過程［3-4］。但GBP1是否對非小細胞肺癌的發病有影響尚不明確。本研究旨探究非小細胞肺癌組織中PADI4、GBP1表達與患者臨床病理特征的關系，以期為臨床針對PADI4及GBP1進行靶向治療提供依據。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選取2015年1月至2018年1月延安大學附屬醫院收治的非小細胞肺癌患者119例。其中男76例，女43例；年齡41～61歲，平均為（55.2±4.4）歲；病理類型：鱗癌50例，腺癌69例；腫瘤分化程度：高分化31例，中分化61例，低分化27例；有淋巴結轉移52例，無淋巴結轉移67例；TNM分期：Ⅰ期27例，Ⅱ期41例，Ⅲ期37例，Ⅳ期14例。本研究經延安大學附屬醫院倫理委員會批準（201403），所有患者簽署知情同意書。

1.2 納入和排除標準 納入標準：（1）符合非小細胞肺癌相關診斷標準［4］；（2）經細胞學、組織學檢查確診者；（3）臨床資料完整者。排除標準：（1）伴有活動性感染及中樞神經系統轉移者；（2）術前進行全身化療、局部放射治療等其他抗腫瘤治療者。

1.3 研究方法 選取兩位經驗豐富的檢驗科醫生作為操作者。取所有患者非小細胞肺癌組織、癌旁組織進行研究，具體操作如下：（1）將組織采用甲醛溶液固定、干燥、脫蠟水化、切片后放入含有抗原修復液的大燒杯中進行抗原修復。（2）取出切片，甩掉并擦干切片上組織周圍的液體，滴加非特異性染色阻斷劑A液（常用3% H2O2），避光孵育10～15 min，滅活內源性過氧化物酶，然后用磷酸鹽緩沖液清洗3次，5 min/次；滴加非特異性染色阻斷劑B液50～100 μl（PADI4抗體與GBP1抗體均以1∶100稀釋），充分覆蓋標本，置于濕盒內，室溫孵育1 h，然后采用磷酸鹽緩沖液清洗3次，5 min/次；以未經免疫的兔免疫球蛋白G（immunoglobulin G，IgG）代替PADI4作為陰性對照；滴加50～100 μl的二抗液（EnVision/HRP二抗），濕盒內室溫孵育15～30 min，然后采用磷酸鹽緩沖液清洗3次，5 min/次；滴加新鮮配制的DAB顯色液，光鏡下控制顯色時間并以自來水終止顯色反應。將已知的宮頸鱗癌組織PADI4及GBP1陽性切片作為陽性對照，磷酸鹽緩沖液代替一抗作為陰性對照。每批染色在相同實驗條件下設陽性對照及陰性對照。PADI4、GBP1陽性表達均定位于細胞質。染色強度分為無染色（0分）、染色淡黃（1分）、染色黃（2分）、染色棕黃（3分）。陽性細胞百分比分為陰性（0分）、≤10%（1分）、＞10%且≤50%（2分）、＞50%且≤80%（3分）、＞80%（4分）。計算染色強度與陽性細胞百分比之積，以0～4分為陰性，5～12分為陽性。

1.4 統計學方法 采用SPSS 21.0統計學軟件進行數據分析。計數資料以相對數表示，組間比較采用χ2檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 PADI4與GBP1在非小細胞肺癌患者不同組織中的表達情況 非小細胞肺癌組織中PADI4、GBP1陽性率高于癌旁組織，差異有統計學意義（P＜0.05），見表1。

表1 PADI4與GBP1在非小細胞肺癌患者不同組織中的表達情況比較〔n（%）〕Table 1 Comparison of expressions of PADI4 and GBP1 in different tissues of patients with non-small cell lung cancer

2.2 非小細胞肺癌組織中PADI4、GBP1表達與患者臨床病理特征的關系 不同性別患者非小細胞肺癌組織中PADI4陽性率比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；鱗癌患者非小細胞肺癌組織中PADI4陽性率高于腺癌患者，有吸煙史患者非小細胞肺癌組織中PADI4陽性率高于無吸煙史患者，高分化及中分化患者非小細胞肺癌組織中PADI4陽性率分別高于低分化患者，無淋巴結轉移患者非小細胞肺癌組織中PADI4陽性率高于有淋巴結轉移患者，Ⅱ期及Ⅲ期患者非小細胞肺癌組織中PADI4陽性率分別高于Ⅰ期及Ⅳ期患者，差異有統計學意義（P＜0.05）。不同性別、淋巴結轉移情況、TNM分期患者非小細胞肺癌組織中GBP1陽性率比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；腺癌患者非小細胞肺癌組織中GBP1陽性率高于鱗癌患者，有吸煙史患者非小細胞肺癌組織中GBP1陽性率高于無吸煙史患者，中分化患者非小細胞肺癌組織中GBP1陽性率高于高分化及低分化患者，差異有統計學意義（P＜0.05），見表2。

表2 非小細胞肺癌組織中PADI4、GBP1表達與患者臨床病理特征的關系〔n（%）〕Table 2 Relationship between PADI4, GBP1 expression in non-small lung cancer tissues and clinicopathological characteristics of patients

2.3 PADI4與GBP1在非小細胞肺癌組織中表達的相關性 非小細胞肺癌組織中PADI4與GBP1的表達有相關性（χ2=5.227，P=0.022），見表3。

表3 PADI4與GBP1在非小細胞肺癌組織中表達的相關性（例）Table 3 Correlation of PADI4 and GBP1 expression in non-small cell lung cancer tissues

3 討論

隨著臨床醫療水平提高，早中期非小細胞肺癌的治療手段逐漸豐富，其中手術切除為首選治療方法，但是手術切除具有病灶清除不徹底、術后復發率高的缺點，且患者預后較差，如何利用新型肺癌相關生物標志物進行靶向治療，降低術后復發率是臨床重點關注的課題［5-7］。PADI4在肺癌及食管癌等惡性腫瘤中特異性表［8］，探究其在肺癌中的作用機制對肺癌治療靶點研究有著重要意義。鳥苷酸結合蛋白家族屬于干擾素誘導的鳥苷三磷酸酶超家族，是一種重要的干擾素刺激基因，其在調控細胞增殖和抵抗病原體感染方面具有重要作用［9］。

3.1 PADI4在非小細胞肺癌組織中表達的意義 NG等［9］研究表明，瓜氨酸化后的細胞角蛋白可有效阻斷細胞凋亡的機制，主要是其不易被含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶降解，可促進腫瘤細胞不斷增殖，并減少腫瘤細胞凋亡，此外在角蛋白8、18、19被瓜氨酸化的過程中抗凝血酶明顯升高，導致與凝血酶活性密切相關的致癌機制被觸發，這是PADI4促使腫瘤細胞惡性增殖的重要機制。國外研究表明，PADI4主要通過與p53蛋白相互拮抗而發揮調節腫瘤細胞凋亡及細胞周期的作用，在針對p53靶基因啟動子的研究過程中，發現高表達的PADI4可有效對抗p53殺傷腫瘤細胞的作用，其通過將組織蛋白H3甲基化位點精氨酸轉變為對腫瘤細胞有利的瓜氨酸而發揮阻斷甲基化作用［10-11］。本研究結果顯示，非小細胞肺癌組織中PADI4陽性率高于癌旁組織，鱗癌患者非小細胞肺癌組織中PADI4陽性率高于腺癌患者，有吸煙史患者非小細胞肺癌組織中PADI4陽性率高于無吸煙史患者，高分化及中分化患者非小細胞肺癌組織中PADI4陽性率分別高于低分化患者，無淋巴結轉移患者非小細胞肺癌組織中PADI4陽性率高于有淋巴結轉移患者，Ⅱ期及Ⅲ期患者非小細胞肺癌組織中PADI4陽性率分別高于Ⅰ期及Ⅳ期患者。這證實了PADI4表達水平與吸煙史有關，與腫瘤細胞增殖調控以及腫瘤發生的關系密切，說明PADI4在鱗癌的發生發展過程中發揮了重要作用，并且很有可能作為一種判斷癌組織分型、分化程度、有無淋巴結轉移及TNM分期的指標。同時，患者腫瘤的惡性程度越高，非小細胞肺癌組織中PADI4表達亦越高，提示PADI4可能與非小細胞肺癌患者的臨床預后有關。

3.2 GBP1在非小細胞肺癌組織中表達的意義 研究表明，GBP1表達可能與宮頸癌患者肌層浸潤及淋巴結轉移有關，其在高、中分化患者和臨床早期患者中均出現大量表達［12-13］。LI等［14］研究表明，多數內皮細胞中的炎癥因子可誘導GBP1大量表達，GBP1通過誘導內皮細胞衰老、凋亡及抑制其增殖、侵襲、轉移等諸多作用，從而抑制炎癥反應和乳腺癌血管形成。GBP1在內皮細胞中的作用與其抗腫瘤作用密切相關。首先從GBP1生物活性的相關研究中可以得出其在內皮細胞生長、分化等多個生理學效應中發揮了重要作用［15］，有關研究表明，通常情況下無法檢測到GBP1的具體表達情況，但其在細胞遷移、生長過程中有重要作用，可以在皮膚受到炎癥刺激時大量表達，尤其在有害藥物刺激下可提高自身活性，并利用過度表達來緩解刺激造成的生理損傷［8，16-17］。本研究結果顯示，腺癌患者非小細胞肺癌組織中GBP1陽性率高于鱗癌患者。說明GBP1在腺癌的發生發展過程中發揮重要作用，并且很有可能作為一種判斷癌組織分型的指標。本研究結果顯示，有吸煙史患者非小細胞肺癌組織中GBP1陽性率高于無吸煙史患者，中分化患者非小細胞肺癌組織中GBP1陽性率高于高分化及低分化患者，這證實了GBP1表達水平與腫瘤細胞增殖調控以及腫瘤發生的關系密切，提示GBP1與吸煙史有關，且可抑制腫瘤細胞轉移、降低致死率。

綜上所述，非小細胞肺癌組織中PADI4、GBP1表達與患者病理類型、吸煙史、腫瘤分化程度有關；此外，非小細胞肺癌組織中PADI4表達與患者淋巴結轉移、TNM分期有關，提示PADI4與GBP1在非小細胞肺癌篩查、診斷、預后及治療指導方面均有一定意義。但本研究為小樣本量、單中心研究，未來需要大樣本量、多中心研究進一步證實本研究結論。

作者貢獻：宋煒、王佳、馬軍偉進行文章的構思與設計；宋煒、馬軍偉進行研究的實施與可行性分析；宋煒、王佳進行論文的撰寫、修訂，統計學處理；宋煒、王佳、王飛娟進行資料收集、整理；馬軍偉負責文章的質量控制及審校，對文章整體負責、監督管理。

本文無利益沖突。