吸入用布地奈德聯合重組人干擾素α-1b注射液霧化干預對呼吸道合胞病毒感染幼鼠模型血清白介素13水平及CD2+ T淋巴細胞占比的影響

董偉然，張燕，安會波，張建偉，周亮

呼吸道合胞病毒（respiratory syncytial virus，RSV）屬于RNA病毒，可以通過空氣以及密切接觸傳播，是引起嬰幼兒呼吸道感染最常見的一種病原體，也是引發全世界范圍內嬰幼兒下呼吸道病毒感染的最主要病原體［1］。研究顯示，2～6個月的嬰兒感染RSV后常可引發嚴重毛細支氣管炎和肺炎，但其引起嚴重下呼吸道感染的機制尚不清楚，其有可能是通過呼吸道上皮細胞間的傳播由上呼吸道播散至下呼吸道所致［2-3］。目前研究表明，嬰幼兒感染RSV后可導致機體免疫功能紊亂，主要表現為輔助性T淋巴細胞（T helper cells，Th）1/Th2比例失衡，常呈現出Th2的優勢免疫應答［4］。白介素13（interleukin-13，IL-13）主要是由活化Th2分泌的一種細胞因子，可促進B淋巴細胞增殖、免疫球蛋白E（immunoglobulin E，IgE）合成、嗜酸粒細胞生成，進而產生一系列炎癥反應，在RSV感染發病過程中（尤其是感染RSV后喘息的發作過程中）具有重要作用［5］。CD2為T淋巴細胞特征性表面標志物，與毒性T淋巴細胞（cytotoxic T lymphocyte，CTL）活性相關，當機體發生病原體感染時可促進T淋巴細胞與其他細胞結合，從而擴大免疫應答反應［6］。目前臨床上對于RSV感染主要以對癥治療和支持治療為主，尚無特異性的治療藥物，患兒合并細菌感染時可聯合抗菌藥物進行治療［7］。布地奈德是糖皮質激素類藥物，具有良好的局部抗炎作用，是治療RSV感染的常用藥物［8］。重組人干擾素α-1b是一種通過克隆基因工程研制的干擾素制劑，具有抗病毒及免疫調節作用［9-10］。因感染RSV患兒具有免疫功能紊亂的特點，本研究組采用吸入用布地奈德聯合重組人干擾素α-1b注射液霧化干預RSV感染幼鼠模型，并觀察其對幼鼠血清IL-13水平及CD2+T淋巴細胞占比的影響，以期為臨床治療RSV感染提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 實驗時間 實驗時間為2020-07-23至2020-08-02。

1.2 實驗動物 SPF級Wistar幼鼠32只，雌雄各半，體質量為（14±2）g，4周齡左右，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供〔經營許可證編號：SCXK（京）200220043〕。

1.3 主要實驗儀器與試劑 RSV Long株病毒液由中國科學院上海巴斯德研究所提供，重組人干擾素α-1b注射液（購自北京三元基因藥業股份有限公司，國藥準字S20010007）、吸入用布地奈德混懸液（購自澳大利亞AstraZeneca Pty Ltd，批準文號H20140475）均由河北省兒童醫院藥房提供，IL-13酶聯免疫吸附試驗（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒購自上海江萊生物科技有限公司，流式細胞儀（Cytomics Fc 500 MCL）購自美國貝克曼庫爾特公司。

1.4 實驗方法

1.4.1 實驗分組及干預方法 所有幼鼠置于清潔無病原體的鼠籠中適應性飼養1周，室溫為（20±2）℃，相對濕度為40%～60%，晝夜光照節律為12 h∶12 h，自由飲水、飲食。采用隨機數字表法將幼鼠分為空白對照組、陽性對照組、布地奈德組及聯合用藥組，每組8只。除空白對照組外，其余各組參照文獻［11］，采用滴鼻法建立RSV感染幼鼠模型，幼鼠首先采用7%水合氯醛聯合七氟烷麻醉，然后經鼻腔接種RSV Long株病毒液，0.1 ml/次，1次/d。空白對照組在同等條件下接種等量不含RSV Long株病毒液的0.9%氯化鈉注射液，0.1 ml/次，1次/d。均連續接種3 d，若幼鼠出現發熱、流涕、喘息、呼吸急促、厭食、蜷臥、豎毛等表現則提示造模成功。參照臨床霧化給藥濃度并根據人與動物藥物等效劑量進行換算配置［12］：從實驗第4天開始，空白對照組和陽性對照組幼鼠給予0.9%氯化鈉溶液霧化干預（10 g/kg），布地奈德組幼鼠給予吸入用布地奈德混懸液霧化干預（0.5 mg/次），聯合用藥組幼鼠給予吸入用布地奈德混懸液（0.5 mg/次）聯合重組人干擾素α-1b注射液（15 μg/次）霧化干預。每組幼鼠均每日早晚各霧化干預1次，連續霧化干預5 d。

1.4.2 觀察各組幼鼠一般情況 觀察各組幼鼠霧化干預后的一般情況，包括呼吸、毛發、活動、體溫、精神狀況等。

1.4.3 標本取材 霧化干預結束后通過眼眶靜脈叢采血方法抽取各組幼鼠血液2 ml，于4 ℃下3 000 r/min離心10 min（離心半徑10 cm），取血清，然后置于-40 ℃冰箱冷凍保存。

1.4.4 ELISA雙抗體夾心法檢測血清IL-13水平 采用ELISA雙抗體夾心法檢測各組幼鼠血清IL-13水平，相關實驗操作嚴格按照試劑盒說明書進行。

1.4.5 流式細胞儀檢測血清CD2+T淋巴細胞占比 采用流式細胞儀檢測各組幼鼠血清CD2+T淋巴細胞占比，相關實驗操作嚴格按照試劑盒說明書進行。

1.5 統計學方法 應用SPSS 22.0統計軟件進行數據分析。計量資料均符合正態分布，以（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組幼鼠一般情況 本實驗過程中各組幼鼠均未出現死亡情況，其中空白對照組幼鼠毛發光滑、有光澤，呼吸頻率正常，活動自如，精神狀態良好，進食正常，體溫正常；陽性對照組幼鼠毛發無光澤、豎立，呼吸急促、喘息，伴有發熱、寒戰，行動遲緩，精神萎靡或煩躁不安，厭食；布地奈德組和聯合用藥組幼鼠毛發光滑、有光澤，呼吸頻率稍快，行動、飲食基本正常，精神狀態一般。

2.2 四組幼鼠血清IL-13水平、CD2+T淋巴細胞占比比較 四組幼鼠血清IL-13水平、CD2+T淋巴細胞占比比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。陽性對照組幼鼠血清IL-13水平、CD2+T淋巴細胞占比高于空白對照組，布地奈德組、聯合用藥組幼鼠血清IL-13水平高于空白對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）；布地奈德組、聯合用藥組幼鼠血清IL-13水平、CD2+T淋巴細胞占比低于陽性對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）；聯合用藥組幼鼠血清IL-13水平低于布地奈德組，差異有統計學意義（P＜0.05），見表1。

表1 四組幼鼠血清IL-13、CD2+ T淋巴細胞占比比較（±s，n=8）Table 1 Comparison of serum levels of IL-13 and CD2+ T lymphocytes in four groups of young mice

表1 四組幼鼠血清IL-13、CD2+ T淋巴細胞占比比較（±s，n=8）Table 1 Comparison of serum levels of IL-13 and CD2+ T lymphocytes in four groups of young mice

注：a表示與空白對照組比較，P＜0.05；b表示與陽性對照組比較，P＜0.05；c表示與布地奈德組比較，P＜0.05

組別 IL-13（pg/ml） CD2+ T淋巴細胞占比（%）空白對照組 4.29±0.26 26.00±0.38陽性對照組 6.97±0.17a 31.84±5.47a布地奈德組 6.16±0.13ab 27.07±1.00b聯合用藥組 5.39±0.35abc 26.96±1.53b F值 176.74 6.61 P值 ＜0.001 0.002

3 討論

RSV是一種中等大小的、膜包裹的RNA病毒，與副流感病毒、腮腺炎病毒、麻疹病毒等均屬于副黏病毒家族，在受染細胞的胞質內發育并且通過胞質膜出芽方式成熟［13］。RSV對嬰幼兒的呼吸道有很強的致病力，其可通過空氣飛沫或直接進入易感者呼吸道而傳播，也可通過間接接觸患兒呼吸道分泌物污染的物品而傳播，嬰幼兒是RSV感染的易感人群，但新生兒感染RSV也較常見，其是引起新生兒嚴重下呼吸道感染的最主要病原體，早產兒發生RSV感染時癥狀更重［14-16］。范麗等［17］對因下呼吸道感染而住院的551例＜1歲嬰兒的RSV感染情況進行調查分析，結果顯示，感染RSV患兒占所有患兒的31.94%（176/551），其中＜6月齡者占74.43%（131/176），且51.14%（90/176）的患兒同時合并細菌感染；感染RSV患兒中出現喘息、鼻塞癥狀者明顯多于未感染RSV患兒。袁琳等［14］對309例RSV肺炎新生兒的臨床和流行病學特點進行分析，結果顯示，RSV感染存在明顯季節性，以冬春季為主；早產患兒占總患兒例數的11.3%（35/309）；患兒早期臨床表現為流涕、鼻塞等上呼吸道感染癥狀，而后可出現咳嗽、喘息，并逐漸加重，重者可有氣促、發紺，而早產兒則以呼吸暫停和發紺為主。黃志英等［18］對江蘇省常州地區的急性呼吸道感染患兒RSV流行病學情況進行調查，結果顯示，RSV是常州地區引起嬰幼兒急性呼吸道感染的重要病原體，但隨年齡增長其感染率逐漸下降，新生兒RSV的感染率最高。本研究結果顯示，空白對照組幼鼠毛發光滑、有光澤，呼吸頻率正常，活動自如，精神狀態良好，進食正常，體溫正常；陽性對照組幼鼠毛發無光澤，呼吸急促、喘息，伴有發熱、寒戰，行動遲緩，厭食等，提示RSV感染造模成功。布地奈德組和聯合用藥組幼鼠毛發光滑、有光澤，呼吸頻率稍快，行動、飲食基本正常，精神狀態一般，較陽性對照組明顯好轉，提示吸入用布地奈德霧化干預和吸入用布地奈德聯合重組人干擾素α-1b注射液霧化干預可有效改善RSV感染幼鼠模型癥狀。

鑒于RSV對嬰幼兒健康造成了極大的威脅，WHO已將RSV疫苗的研發列為首要發展的疫苗之一［19］。盡管各個國家對RSV疫苗的研制投入了巨大的人力、物力，由于病毒本身的特點和RSV感染人群的特點，目前尚沒有有效的疫苗被批準應用。因此，目前臨床上對于RSV的治療還是以支持治療和對癥治療為主，但由于不同亞型RSV的中和抗體不能提供有效的亞型間交叉保護作用，RSV感染不能產生完全免疫，故臨床可出現反復多次感染［20］。重組人干擾素α-1b是我國自主研發的新型基因工程類藥物，是一種多功能活性蛋白質，其雖然并不能直接殺傷或抑制病毒，但可以通過與細胞表面受體作用，使細胞產生抗病毒蛋白，從而抑制病毒的復制，同時還可增強自然殺傷細胞、巨噬細胞和T淋巴細胞的活力，起到免疫調節作用，并增強抗病毒能力。黃艷嫻等［21］研究表明，RSV可對小鼠酪氨酸蛋白激酶（januskinase，JAK）/信號傳導與轉錄活化因子（signal transducer and activator of transcription，STAT）信號通路產生抑制作用，而JAK/STAT信號通路對機體的免疫應答、免疫細胞分化發育及炎癥反應均有重要的調節作用，而重組人干擾素α-1b可明顯促進STAT1、STAT2蛋白表達，提高JAK/STAT信號通路的活性，調節免疫功能，進而發揮抗病毒作用。糖皮質激素是一類極其重要的調節分子，對機體的生長、發育、代謝及免疫功能等起著重要的調節作用，是臨床上使用最為廣泛而有效的抗炎和免疫調節劑。其中布地奈德是臨床上常用的吸入型糖皮質激素，具有快速、強大的非特異性抗炎作用，對各種炎癥反應均有療效，在炎癥初期既能抑制毛細血管擴張，減輕滲出和水腫，又能抑制白細胞的浸潤和吞噬，減輕炎癥癥狀；在炎癥后期能抑制毛細血管和纖維母細胞的增殖，延緩肉芽組織的生成，避免粘連等炎癥后遺癥的發生。布地奈德還有很好的免疫抑制作用，小劑量時主要抑制細胞免疫，大劑量時能夠抑制漿細胞和抗體生成，抑制體液免疫功能，減少IgE的分泌。何為［20］認為，RSV感染可直接損傷氣道黏膜，導致分泌物增多，并誘導機體發生免疫應答，促進炎癥因子分泌，從而導致氣道高反應性，出現喘息等癥狀，氣道炎癥反應是RSV毛細支氣管炎發生發展的關鍵因素，而布地奈德能夠通過與細胞膜、細胞質的皮質醇受體結合，阻止炎癥細胞活化，抑制炎癥因子的合成與釋放，減輕氣道高反應性狀態，從而達到改善臨床癥狀的目的。郭穎等［22］進一步研究布地奈德對RSV感染哮喘模型小鼠肺損傷的保護機制，結果顯示，布地奈德能夠抑制小鼠肺組織中高遷移率族蛋白B1（high mobility group box 1，HMGB1）和Toll樣受體4（Toll-like receptors 4，TLR-4）的表達，減輕炎癥細胞浸潤，減少血清和肺泡灌洗液中炎癥細胞總數，誘導Th1細胞因子——干擾素γ（interferon-γ，IFN-γ）、IL-2的表達，降低Th2因子——IL-13和嗜酸粒細胞趨化因子的表達，促進Th1/Th2恢復平衡，減輕氣道炎癥。

有研究認為，RSV感染引起的免疫功能紊亂是誘發患兒氣道慢性炎癥反應和氣道高反應性的主要病理機制，主要表現為Th1/Th2失衡，并呈現Th2優勢免疫應答狀態，大量可溶性炎性因子被釋放而引起炎癥和組織損傷［23-24］。IL-13是由Th2分泌的一種多效性細胞因子，能夠促進B淋巴細胞增殖，增強樹突狀細胞和巨噬細胞的活性，活化嗜酸粒細胞，并驅使B淋巴細胞分泌IgE，而IgE是引起哮喘的主要效應分子，能夠促進氣道黏液的分泌和氣道高反應性的形成［25-26］。有研究認為，IL-13水平升高是導致患兒感染RSV后發生喘息甚至哮喘的重要原因，其在哮喘和RSV感染所引起的免疫炎癥反應過程中具有十分重要的作用［6，27-28］。常健等［29］研究也表明，IL-13在兒童RSV毛細支氣管炎轉變為哮喘的過程中起主要作用，患兒病情可隨著IL-13水平的降低而減輕。夏虎等［30］研究表明，RSV感染可上調哮喘模型小鼠氣道上皮細胞中胸腺基質淋巴細胞生成素（thymic stromal lymphopoietin，TSLP）的表達，促進Th2因子——IL-4、IL-5、IL-13等的分泌，加重小鼠肺部Th2型炎癥反應。CD2是廣譜且較穩定的T淋巴細胞抗原，表達于成熟T淋巴細胞及胸腺細胞，能夠促進T淋巴細胞與抗原呈遞細胞的黏附，促進炎癥反應［31］。梁敏等［32］研究表明，負向調控CD2相關蛋白（CD2-associated protein，CD2AP）可以抑制RSV感染導致的支氣管上皮細胞的炎癥反應及細胞凋亡，從而減輕細胞損傷。本研究結果顯示，陽性對照組幼鼠血清IL-13水平、CD2+T淋巴細胞占比高于空白對照組，布地奈德組、聯合用藥組幼鼠血清IL-13水平高于空白對照組；布地奈德組、聯合用藥組幼鼠血清IL-13水平、CD2+T淋巴細胞占比低于陽性對照組；聯合用藥組幼鼠血清IL-13水平低于布地奈德組；提示RSV感染幼鼠模型血清IL-13、CD2+T淋巴細胞占比升高，而吸入用布地奈德霧化干預和吸入用布地奈德聯合重組人干擾素α-1b注射液霧化干預可降低其血清IL-13水平、CD2+T淋巴細胞占比，且吸入用布地奈德聯合重組人干擾素α-1b注射液霧化干預的效果更好，這與吳瑩等［33］、范增婧［34］研究結果基本一致。吳瑩等［33］采用重組人干擾素α-1b聯合布地奈德霧化吸入治療小兒RSV毛細支氣管炎，并與單純采用布地奈德霧化吸入治療比較，結果顯示，聯合用藥組的總有效率明顯高于對照組（95.75%比78.72%，P＜0.05），且聯合用藥組治療后肺功能指標——吸氣呼氣時間比、每千克體重潮氣量均高于對照組，呼吸阻力小于對照組，并指出聯合用藥能促進Thl/Th2恢復平衡，減輕氣道炎癥反應。范增婧［34］采用重組人干擾素α-1b聯合布地奈德治療小兒RSV毛細支氣管炎，并與單純布地奈德治療比較，結果顯示，聯合組總有效率明顯高于對照組（96.67%比81.67%，P＜0.05），且聯合組治療后咳嗽、喘憋、哮鳴音等癥狀緩解時間及住院時間均短于對照組，用力肺活量、第1秒用力呼氣容積均大于對照組，在改善患兒臨床癥狀的同時可有效提高患兒呼吸功能。分析原因，一方面，布地奈德具有抗炎和免疫抑制作用，可誘導抗炎因子合成，抑制炎癥因子合成，減輕氣道炎癥反應和氣道高反應性；另一方面，重組人干擾素α-1b可調節免疫功能，增加機體的抗病毒能力，抑制病毒復制，標本兼治，從而能夠有效提高治療效果。此外，霧化干預對于嬰幼兒來說安全性好、治療指數高，可使藥物直接作用于氣道黏膜上皮細胞，避免肝臟首過效應，能夠更快、更有效地發揮藥物療效，且霧化吸入藥量較全身用藥量小，可避免或減少糖皮質激素全身給藥可能產生的不良反應，家屬接受度高，從而提高患兒的治療依從性［35-36］。

綜上所述，吸入用布地奈德聯合重組人干擾素α-1b注射液霧化干預可降低RSV感染幼鼠模型血清IL-13水平、CD2+T淋巴細胞占比，其可能通過抑制炎癥反應、調節免疫功能而提高治療效果。但本研究觀察指標相對單一，未對深層次的信號通路作用機制進行探討，是否還有其他方面的作用途徑和作用機制有待將來深入研究。

作者貢獻：周亮進行文章的構思與設計，負責文章的質量控制及審校，對文章整體負責、監督管理；張燕、安會波、周亮進行研究的實施與可行性分析；張建偉進行數據收集、整理；董偉然、周亮進行結果的分析與解釋、論文的修訂；董偉然撰寫論文。

本文無利益沖突。