基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法探索青黛治療潰瘍性結(jié)腸炎的作用機制*

甘麗華，楊 坤，李志敏，何 泉，郭超峰

1 廣西中醫(yī)藥大學(xué)，廣西 南寧 530000；2 廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院

潰瘍性結(jié)腸炎（ulcerative colitis，UC）是一種慢性非特異性消化道炎癥疾病，目前病因尚未明確，被世界各國衛(wèi)生組織列為疑難性疾病之一［1］，以結(jié)直腸黏膜屏障破壞，腸道菌群紊亂，彌漫性炎癥改變?yōu)樘攸c?；颊叱１憩F(xiàn)為腹痛、腹瀉、里急后重及黏液膿血便等特點。西醫(yī)認為UC多與免疫應(yīng)答與炎癥反應(yīng)有關(guān)，采用氨基水楊酸類、糖皮質(zhì)激素及免疫抑制劑等治療［2-3］，但需長期使用，易對藥物產(chǎn)生依賴性，不耐受，繼發(fā)新的感染，達不到理想治療效果。UC 屬中醫(yī)學(xué)“泄瀉”“痢疾”“腸辟”等范疇，主要病機為濕熱蘊結(jié)腸道，氣血不調(diào)［4］，治療以化濕為主，輔以清熱解毒或健脾等法。

據(jù)2015 版《中華人民共和國藥典》記載青黛是蓼科植物蓼藍，爵床科植物馬藍和十字花科植物菘藍的莖或葉加工后的干燥粉末或顆粒，具有清熱解毒、涼血消斑等功效［5］。《本經(jīng)逢源》中記載青黛具有“散郁火，治溫毒發(fā)斑及產(chǎn)后熱痢下重”的功效。陳銘詩［6］采用復(fù)方青黛顆粒聯(lián)合美常安治療UC，可降低患者疾病活動指數(shù)，增加T淋巴細胞水平，調(diào)節(jié)機體免疫，保護腸黏膜屏障。馬文強等［7］研究青黛在UC 模型小鼠的體內(nèi)作用機制，發(fā)現(xiàn)青黛能有效抑制小鼠體內(nèi)炎癥因子和細胞凋亡因子釋放，提高抗凋亡因子水平，阻斷炎癥形成。日本單中心研究發(fā)現(xiàn)，患者口服青黛治療UC后出現(xiàn)肝損傷，惡心頭痛，感染性結(jié)腸炎等不良反應(yīng)但停藥后可逆［8］。

目前青黛基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究尚少［9］。現(xiàn)采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法探討青黛治療UC的作用機制。

1 資料與方法

1.1 應(yīng)用數(shù)據(jù)庫及相關(guān)軟件中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP)（http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）、通用蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫Uniprot（https：//www.uniprot.org/）、人類基因數(shù)據(jù)庫Gene Cards（https：//www.genecards.org/）、R 語言分析軟件R3.6.1（https：//www.r-project.org/）、網(wǎng)絡(luò)拓撲屬性分析軟件Cytoscape 3.7.2（http：//cytoscape.org/）、蛋白質(zhì)互作平臺String（https：//www.string-db，org/）、生物學(xué)信息注釋數(shù)據(jù)庫David 6.8（https：//david.ncifcrf.gov/）及函數(shù)繪圖軟件Origin 9（https：//www.originlab.com/）。

1.2 青黛活性成分及靶點預(yù)測在TCMSP 數(shù)據(jù)庫中以“青黛”為關(guān)鍵詞進行檢索，獲取其拉丁名，檢索青黛化合物信息，根據(jù)口服生物利用度（oral bioavailability，OB）＞30%和藥物相似性（druglikeness，DL）＞0.18兩個生物活性指標篩選出符合條件的有效成分。并在TCMSP 數(shù)據(jù)庫Related Targets 中檢索青黛全部活性靶點，篩選出與上述有效成分相關(guān)的靶點，將這些靶點蛋白名稱導(dǎo)入UniProt數(shù)據(jù)庫，將靶點蛋白全稱轉(zhuǎn)換成相對應(yīng)靶基因簡稱，整合靶基因，刪除數(shù)據(jù)庫不存在的基因，最終得到青黛有效成分靶點。

1.3 疾病靶點預(yù)測以UC 的英文名“ulcerative colitis”為檢索關(guān)鍵詞在Gene Cards 數(shù)據(jù)庫中找出UC的相關(guān)基因。

1.4 藥物對疾病潛在靶點預(yù)測和調(diào)控網(wǎng)絡(luò)圖在R 軟件中找出青黛活性成分的靶點與潰瘍性結(jié)腸炎相關(guān)基因兩者的交集并繪制出Venn 圖，初步預(yù)測青黛治療UC 潛在作用靶點。再將藥物有效成分及作用靶點和疾病的相關(guān)基因等導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2 軟件，得出藥物-成分-疾病-靶基因思維關(guān)系圖并將其關(guān)系進行可視化。

1.5 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)（PPI）的構(gòu)建運用String 軟件將藥物靶點與疾病基因相交集的蛋白基因進行蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)（PPI）構(gòu)建，并找出核心基因。

1.6 基因本體論及基因和基因組的京都百科全書分析將“青黛”有效作用于疾病的靶點上傳至David 6.8數(shù)據(jù)庫，以Homo spapiens為研究對象，選 擇Gene-Ontology（3 selected）和Pathways（3 selected）條目，設(shè)置P值（P＜0.01），進行基因本體論功能富集（gene ontology，GO）分類分析了解靶點的主要作用過程以及KEGG 富集（kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路分析，觀察靶點在通路中的分布情況。將結(jié)果導(dǎo)入Origin 9 畫圖軟件中繪制出相關(guān)的生物學(xué)過程及信號通路圖。

2 結(jié)果

2.1 藥物活性成分以“青黛”為關(guān)鍵詞從TCMSP共檢索出29個活性化合物，以O(shè)B＞30%，DL＞0.18為標準，共篩選出9個活性有效成分及其參數(shù)信息。其中靛藍二聚體和靛甙沒有有效靶點對應(yīng)。見表1。

表1 青黛有效活性成分基本信息

2.2 青黛調(diào)控UC網(wǎng)絡(luò)圖利用UniProt數(shù)據(jù)庫對TCMSP 獲得的100 個靶蛋白全稱進行簡稱轉(zhuǎn)換后獲 得48 個靶基因，結(jié)合Gene Cards 找出UC 的4209個相關(guān)基因，兩者取交集后共得到31個共同靶基因。利用Cytoscape 軟件構(gòu)建中藥化合物-疾病靶點相互作用網(wǎng)絡(luò)，結(jié)果顯示該網(wǎng)絡(luò)共有38個節(jié)點（7 個化合物節(jié)點，31 個靶點節(jié)點），疾病1個，31個共同靶基因，邊85條，有對應(yīng)靶標的化合物7 個（分別為靛玉紅、靛藍、異靛藍、異牡荊素、β-谷甾醇、吲哚類及喹啉類化合物）其中靛玉紅和β-谷甾醇作用靶點最多，分別為17個和12個。見圖1。

圖1 藥物-靶點-疾病-基因網(wǎng)絡(luò)

2.3 PPI 網(wǎng)絡(luò)及關(guān)鍵靶點在STRING 數(shù)據(jù)平臺上輸入31個共同靶點，導(dǎo)出PPI蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖，圖中含有30 個靶蛋白和150 組互作邊，其中PRSS1 是游離蛋白，故將其刪除。其中節(jié)點代表一個蛋白，兩蛋白之間用邊相連，邊的度值由藍色變黃色逐漸變小，邊越粗表示核心地位越大。其中排名前5 的蛋白分子為JUN（轉(zhuǎn)錄因子AP-1）、CASP3（半胱天冬酶3）、CASP8（半胱天冬酶8），PTGS2（人前列腺素G/H合成酶2）、RELA（轉(zhuǎn)錄因子p65）。度值越大的蛋白質(zhì)在整個網(wǎng)絡(luò)中起關(guān)鍵作用，同時也是青黛治療UC的關(guān)鍵靶點，見圖2—3。

圖2 青黛治療UC相關(guān)靶點的PPI網(wǎng)絡(luò)

圖3 青黛治療UC關(guān)鍵靶點

2.4 GO 富集分析GO 富集分類分析獲得條目共84 條，其中生物過程（BP）、細胞組成（CC）和分子功能（MF）條目分別為66、5、13 條。生物過程主要包括細胞對有毒物質(zhì)的反應(yīng)、RNA 聚合酶Ⅱ啟動子轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控、對有機物的反應(yīng)等；細胞組成主要包括胞質(zhì)、高爾基體、核等；分子功能主要包括血紅素結(jié)合、轉(zhuǎn)錄因子活性、sequence-specific DNA結(jié)合等。將前10位生物過程結(jié)果導(dǎo)入Origin 9畫圖軟件，根據(jù)P值（P＜0.01）和基因富集數(shù)目的多少繪圖，見圖4。

圖4 青黛治療UC的GO富集分析BP圖（前10位）

2.5 KEGG 通路分析KEGG通路富集分析得到93條通路（P＜0.01）。其中與炎癥反應(yīng)和免疫應(yīng)答相關(guān)的信號通路有白細胞介素17(interleukin-17，IL-17)信號通路、磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)-蛋白激酶B(protein kinase B，Akt)信號通路、Toll 樣受體(Toll like receptor，TLRs)信號通路等，體現(xiàn)青黛治療UC 的多通路特點，部分通路見表2和圖5。

圖5 青黛治療UC的KEGG通路分析氣泡圖

表2 青黛治療UC的KEGG通路分析

3 討論

現(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，青黛具有類皮質(zhì)激素樣作用，能抑制平滑肌，降低毛細血管通透性，調(diào)節(jié)機體免疫功能，具有抗菌，抗病毒和抗腫瘤作用［12］，主要治療UC、銀屑病和白血病3 類疾病［13］。本研究發(fā)現(xiàn)青黛包含多種有效成分，可作用于UC多個相關(guān)靶點及代謝通路，有減少炎癥細胞浸潤，保護腸黏膜作用。

3.1 有效成分與靶點蛋白經(jīng)檢索TCMSP 和網(wǎng)絡(luò)構(gòu)圖分析結(jié)果顯示，青黛有對應(yīng)靶點的前5 個活性成分是靛玉紅、β-谷甾醇、異牡荊素、氧代吲哚啉類及靛藍對應(yīng)靶點分別為17、12、5、5、4 個，體現(xiàn)青黛治療UC 多成分和多靶點特性。劉麗娟等［14］研究發(fā)現(xiàn)靛藍可下調(diào)體內(nèi)IL-6 水平，發(fā)揮對UC 的體外抗炎作用。李楠等［15］研究靛玉紅對實驗性UC 大鼠的作用機制，結(jié)果顯示靛玉紅可提高結(jié)腸中ITF mRNA 表達，降低轉(zhuǎn)化生長因子β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)水平，達到抑制UC 炎癥的效果。DING KANG 等［16］實驗發(fā)現(xiàn)β-谷甾醇能增加小鼠腸上皮細胞抗菌肽的表達，減少鼠型傷寒沙門氏菌的生存，減少白細胞和凋亡因子的浸潤，保護腸道屏障功能［17］。經(jīng)PPI關(guān)鍵靶點分析，青黛作用于UC 的關(guān)鍵靶點可能是JUN、CASP3、PTGS2、CASP8、RELA 等。相關(guān)文獻報道，JUN 是AP-1（由c-Jun 和c-Fos 構(gòu)成）單位之一，AP-1是位于JNK下游的關(guān)鍵信號蛋白分子，而AP-1 高頻出現(xiàn)在炎癥信號通路上，JNK 通路受上游刺激后，被磷酸化激活，進而激活JUN，使炎癥啟動并增強其轉(zhuǎn)錄［18］，此外c-Jun 的高表達可能參與UC 的發(fā)展［19］。CASP 家族以無活性酶原存在于細胞質(zhì)中，接受各種細胞凋亡的信號后激活CASP 系列蛋白分子，使其裂解細胞生存的蛋白，參與細胞凋亡和組織損傷過程［20］，CASP3 與UC 上皮細胞凋亡關(guān)系密切［21］。PTGS2 也稱為COX-2，是一種合成前列腺素和炎癥反應(yīng)的有效酶，參與人體炎癥反應(yīng)，是治療UC 的重要靶點［22］。相關(guān)文獻結(jié)果與本研究分析的青黛活性成分與靶點蛋白的作用結(jié)果相一致，青黛能減少相關(guān)炎癥蛋白分子對腸黏膜的破壞，改善胃腸道功能，對UC 產(chǎn)生治療效果。

3.2 富集與通路分析GO 分類分析結(jié)果顯示，青黛有效成分分布在細胞質(zhì)和細胞核中，主要通過對有毒物質(zhì)的反應(yīng)和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等生物過程及轉(zhuǎn)錄因子活性和DNA結(jié)合等分子功能來發(fā)揮對UC的防治作用。KEGG 通路分析結(jié)果顯示，青黛能影響不同通路，其中IL-17信號通路、TLRs信號通路和PI3K/Akt 信號通路與UC 聯(lián)系密切［23-25］。DEJEA 等研究發(fā)現(xiàn)IL-17 信號通路與炎癥腸病相關(guān)［26］，施沛青等［27］實驗表明IL-17 具有強大的促炎活性，通過環(huán)氧合酶2(cyclooxygenase，COX-2)誘導(dǎo)炎癥細胞釋放，并可以同腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factorα，TNF-α)和干擾素γ(interferonγ，IFN-γ)蛋白分子發(fā)揮協(xié)同作用，放大炎癥反應(yīng)，促進UC 發(fā)展。TLRs 信號通路是天然免疫系統(tǒng)中的細胞跨膜受體［28］，TLRs 與接頭蛋白結(jié)合激活核轉(zhuǎn)錄因子κB(nuclear factor-κB，NF-κB)進入核內(nèi)，并激活各種炎癥因子轉(zhuǎn)錄，增加樹突狀T 淋巴細胞的活性，介導(dǎo)腸道黏膜免疫反應(yīng)［29］，增強腸道黏膜損傷，是UC 患者活動期臨床癥狀加重的重要因素［30］。PI3K/Akt 信號通路在細胞增殖分化和凋亡中發(fā)揮重要作用，與UC 發(fā)生關(guān)系密切［31-32］，PI3K/Akt 信號通路被激活后，具有活性的Akt 會促使NF-κB 的激活，NF-κB 激活后可增強促炎因子和白細胞介素的轉(zhuǎn)錄，從而引起一系列炎癥反應(yīng)和黏膜損傷，促進UC的發(fā)生和發(fā)展［33］。

4 結(jié)論

本研究以青黛7 種有效成分為研究對象，探索青黛的靶點和通路，結(jié)果顯示青黛活性成分可能通過作用于CASP3、PTGS2、JUN 等靶點來阻斷IL-17 炎癥反應(yīng)通路及TLRs 信號通路的形成，減少對腸道黏膜屏障的破壞，調(diào)節(jié)機體免疫，發(fā)揮對UC 的治療作用。但本研究尚有不足之處：缺乏實驗室驗證；青黛來源不同，活性成分也有差別；網(wǎng)絡(luò)信息更新不及時，數(shù)據(jù)滯后，給網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究帶來局限性。