三黃凝膠通過調控P38MAPK/ERK 信號通路干預痤瘡的作用機制*

郭斐斐，王思農，牛凡琪，劉 婧，牛凡紅

甘肅中醫藥大學，甘肅 蘭州730000

近年來，由多種因素造成體表菌群失調誘發的炎癥反應成為痤瘡發病機制中研究的重點內容［1］，相關研究表明，從起病階段的白頭、黑頭粉刺到中期丘疹和紅斑，再到后期色素沉著、痤瘡瘢痕的形成，炎癥反應貫穿痤瘡發病的各個階段［2］。絲裂原活化蛋白激酶（mitogen activated protein kinase，MAPK)/細胞外調節蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases，ERK)信號通路可傳導刺激信號，介導細胞進行一系列的病理反應［3］。本研究觀察三黃凝膠對痤瘡大鼠的干預機制，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物SPF 級Wistar 雌性大鼠48 只，周齡4～8 周，體質量（180±20）g，由甘肅中醫藥大學動物實驗中心提供。實驗動物許可證號：SCXK（甘）2018-005。喂養條件一致。

1.2 藥品與試劑三黃凝膠［含3.6 g（生藥）/10 g，院內制劑試生產階段，由窯街煤電集團有限公司總醫院提供］；0.025%維A 酸乳膏（商品名：迪維，重慶華邦制藥有限公司，國藥準字：H50021817，規格：15 g/盒）；100%油酸500 mL（天津市富宇精細化工有限公司，批號：101212）。磷酸化-細胞外信號調節激酶(P-ERK)試劑盒（上海莼試生物科技有限公司，貨號：CS-E02542）；血清磷酸化-絲裂原活化蛋白激酶P38 抗體（P-P38MAPK）試劑盒（上海白益生物科技有限公司，貨號：BY-PD5629S）。

1.3 方法

1.3.1 三黃凝膠制備方法 將三黃膏經驗方中的黃芩、黃連、黃柏、苦參、白芷、丹參、紫草等進行低溫滅菌，粉碎干燥，制成粗顆粒，過200 目篩，用乙醇做溶劑，用滲漉法提取有效成分溶液，溶液靜置24 h 后，過濾，將冰片溶于濾液中，配制成三黃原液。對原液進行脫色處理，將脫色液低溫濃縮備用，得三黃濃縮液。加入4.5 倍蒸餾水，再加入40%NaOH 調節pH 至6.0～7.0 制成三黃pH 調節液備用。將4%Cb940、2%月桂氮酮、10%甘油均勻混合制成成膠基質，將三黃pH 調節液、成膠基質、0.2%山梨酸鉀、2.0%～2.5%的三乙醇胺均勻攪拌混合，加蒸餾水，即得三黃凝膠［4］。

1.3.2 造模 將48 只大鼠遵循簡單排序隨機化原則分為6 組，適應環境24 h 后，除空白組外，其余5 組開始造模，造模方法［5］：每只大鼠右耳內側耳廓導管開口處涂抹100%油酸，每次0.5 mL，每日1 次，連續造模3 周。隨機取2 只模型鼠，取鼠耳進行蘇木精-伊紅染色法（HE 染色）染色及形態學、病理學觀察，結果（+）～（+++）表示大鼠痤瘡模型造模完成。痤瘡組織學判定標準［6］見表1。

表1 痤瘡組織學判定標準

1.3.3 分組及給藥 根據臨床有效劑量與大鼠用藥量換算，給藥方案：維A酸乳膏組5 g/（kg·d）；三黃凝膠低、中、高劑量組分別用0.02、0.04、0.08 g（生藥）/（kg·d）每日1 次，外用涂抹4 周。空白組與模型組外用生理鹽水涂抹4 周，每日1次。

1.4 觀察指標

1.4.1 大鼠耳廓皮損情況 造模3周后隨機取2只模型鼠，切取其造模右耳，HE 染色進行病理學觀察，判斷造模效果。干預4 周后處死大鼠，切取大鼠造模右耳，HE 染色，進行組織病理學觀察。

1.4.2 大鼠血清P-P38MAPK、P-ERK含量測定 干預結束后大鼠心臟采血，采用酶聯免疫吸附試驗(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)法檢測血清中P-P38MAPK及P-ERK含量。

1.5 統計學方法采用SPSS 25.0 軟件分析數據，計量資料以表示，采用t檢驗，P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 大鼠耳廓皮損組織病理學空白組：表皮及角質層未見明顯增厚，結構完整，皮脂腺及毛囊未見擴張。模型組：表皮及角質層增厚，顆粒層及棘細胞層增厚明顯，毛囊及皮脂腺擴張，角栓堵塞于毛囊內，見大量角化物質堆積，淋巴細胞浸潤明顯。干預后維A酸乳膏組：表皮及角質層較模型組變薄，毛囊稍有擴大，皮脂腺結構正常，偶見淋巴細胞浸潤。干預后三黃凝膠高劑量組：表皮及角質層明顯變薄，毛囊及皮脂腺體積縮小，見少量角化物質，淋巴細胞浸潤數目減少。干預后三黃凝膠中劑量組：表皮及角質層較模型組變薄，結構完整，皮脂腺擴大，毛囊漏斗部可見少量致密角化物質，淋巴細胞浸潤較模型組減輕。干預后三黃凝膠低劑量組：表皮結構完整，增厚明顯改善，淋巴細胞浸潤減少，毛囊及皮脂腺擴大程度減輕。見圖1。

圖1 各組大鼠耳廓皮損的組織病理學（HE×100）

2.2 血清P-P38MAPK、P-ERK 含量模型組大鼠血清P-P38MAPK 含量較空白組升高（t=-37.46，P＜0.01）。維A酸乳膏組及三黃凝膠低、中、高劑量組大鼠血清P-P38MAPK含量降低（P＜0.01）。三黃凝膠中、低劑量組大鼠血清P-P38MAPK含量與維A酸乳膏組相比較，差異無統計學意義（t5=-1.46，t6=-2.07，P＞0.05），三黃凝膠高劑量組與維A 酸乳膏組相比較，差異有統計學意義（t=5.09，P＜0.05）。模型組大鼠血清P-ERK含量高于空白組（t=-44.84，P＜0.01）。維A 酸乳膏組及三黃凝膠低、中、高劑量組大鼠血清P-ERK 降低（P＜0.01）。三黃凝膠低、中劑量組與維A酸乳膏組相比較，差異無統計學意義（t5=1.03，t6=-0.18，P＞0.05）。三黃凝膠高劑量組與維A 酸乳膏組相比較，差異有統計學意義（t=9.63，P＜0.01）。見表2。

表2 各組大鼠血清P-P38MAPK及P-ERK含量（）

表2 各組大鼠血清P-P38MAPK及P-ERK含量（）

注：*表示與空白組比較，P＜0.01；△表示與模型組比較，P＜0.01；※表示與維A酸乳膏組比較，P＜0.05。“-”表示等劑量生理鹽水

3 討論

作為人體最大的保護器官［7］，皮膚成為繼腸道后第二大復雜的微生態系統，其表面定居各種復雜的細菌、古生菌、真菌和病毒，保持各種微生物共存的動態平衡不僅不會傷害到皮膚組織本身的結構和功能，還能對外來刺激起防御抵抗作用［8］，由于各種體內外因素打破了這種動態平衡，微生物入侵皮膚，導致皮膚及機體發生應答反應，產生各種病理變化。近年來醫者越來越重視痤瘡丙酸桿菌增殖在痤瘡發病過程中的作用［9］，認為痤瘡丙酸桿菌的增殖過程打破了皮膚的動態平衡，促進病變發展，痤瘡丙酸桿菌表面的肽聚糖（peptidoglycan，PGN）和脂磷壁酸（lipoteichoic acid，LTA）激活巨噬細胞表面的炎癥信號通路，從而發生一系列炎癥反應［10］。P38MAPK 通路是存在于細胞表面的一種促蛋白質磷酸化酶，是MAPK 通路中最重要的一條亞通路［3］，具有參與炎癥反應，誘導細胞分化、凋亡的作用，ERK 是重要的信號傳導通路，將外來刺激信號傳達到細胞核內［11］。痤瘡丙酸桿菌過度增殖導致皮膚表面微生態環境被破壞，該通路將信號轉導至細胞，引導表皮及真皮細胞進行分化、凋亡，促使淋巴細胞浸潤。

中醫古籍稱痤瘡為“粉刺”“酒刺”“面粉皶”“肺風粉刺”等。《黃帝內經》中首次提到風、寒、濕、熱之邪促其發病。《外科大成·肺風酒刺》中指出肺衛失調發病及從肺經論治粉刺的觀點。后世醫家認為粉刺的發病與飲食不潔、胃腸積熱；肝氣不暢、氣機阻滯，郁而化熱；肝胃不和，傷及肺臟，發為粉刺。后又提出陰虛發病的觀點，認為粉刺發病離不開腎陰氣虛，精血不能濡養，外邪復擾，無力抵抗，發為粉刺［12］。五臟失衡發病的觀點為后世醫家提供了診治思路。三黃凝膠是在王文春教授的經驗方“三黃膏”的基礎上加減化裁而成，方中黃芩、黃連、黃柏為君，性味苦寒，泄三焦郁熱。黃芩歸肺經，清肺熱，燥濕涼血，活血散結；黃連歸心、脾、肝經，清心瀉火，涼血消肝；黃柏歸腎經，滋陰瀉火，解毒燥濕。從五臟論治，使五臟調達，正氣盛則邪去；苦參、丹參苦寒，主清熱燥濕，活血涼血，解毒消癰；白芷微溫，平和諸藥之苦寒，以防諸藥寒涼傷及脾胃，兼消腫排膿散結；紫草、冰片活血涼血，通諸竅，暢情志。現代藥理研究表明：黃芩的最小抑菌濃度為31.25 mg/mL 時對痤瘡丙酸桿菌及表皮金黃色葡萄球菌的抑菌效果最明顯［13］。黃連可對抗病原微生物增殖，抑制毛囊擴張，抑制皮脂腺過多分泌油脂，調節面部水油平衡［14］；黃柏可調節皮膚表面菌群失調，促進表皮修復［15］；苦參中所含苦參堿有抗炎、抗病毒、調節機體免疫平衡的作用［16］；白芷中所含歐前胡素、異歐前胡素具有抗炎、抗感染且能軟化角質的作用［17］；丹參中含有的丹參酮可抑制炎癥細胞趨化性，抑制炎癥發展，還可調節體內激素水平［18］；紫草中紫草素可抑菌、抗感染，且能調節人體免疫系統，增強機體免疫能力［19］；冰片在抗炎的同時還增加組方中藥的透皮吸收率，2%天然冰片和2%合成冰片對于藥物的經皮吸收效果最好［20］。諸藥合用清熱涼血，活血散瘀，治療痤瘡。

三黃凝膠采用凝膠機制，改進了三黃膏的制備工藝，使藥物濃度更高，透皮吸收率更高，增加了藥物的有效治療時間，同時還可減少痤瘡患者面部色素沉著及預防痤瘡瘢痕的形成。本實驗結果表明，三黃凝膠可促進恢復痤瘡大鼠模型表皮微生態環境的動態平衡，改善痤瘡癥狀。