響應曲面法優化小葉紅葉藤揮發油包合物的制備工藝及評價*

袁彩英，劉本濤，黃嘉詠，嚴振碩，謝長江，霍麗妮，陳 睿，2△

1 廣西中醫藥大學藥學院，廣西 南寧 530001；2 廣西中醫藥大學賽恩斯新醫藥學院

小葉紅葉藤（Rourea microphylla）是牛栓藤科紅葉藤屬攀援灌木，主要分布在福建和廣西等地，其莖葉具有清熱解毒、消腫止痛等功效。其所特含的香氣使之成為廣西壯族人民喜愛的保健茶飲［1］。小葉紅葉藤主要含有蒽醌類、黃酮類、甾體、脂肪酸類、萜類及香豆素類等化學成分［2-3］。目前，對小葉紅葉藤的研究處于初步探索階段，本課題組已完成對小葉紅葉藤揮發油的化學成分分析及抗氧化活性的初步研究［1］。由于小葉紅葉藤揮發油的溶解性及穩定性較差，因此，在探索其藥理活性時遇到了一定阻礙。

研究表明，很多揮發油類物質具有抗腫瘤［4］、抗病毒和抗菌［5］、抗抑郁［6］、抗氧化［7］等功效。因其化學性質不穩定，水溶性欠佳，臨床應用多為直接溶解噴灑或加入一定增溶劑以制備成各種制劑，但仍存在穩定性欠佳，難以長時間保存等問題［8］。β-環糊精（β-cyclodextrin，β-CD）是被制藥行業廣泛應用的藥用輔料，其疏水空腔能通過主-客體的作用力對親脂性物質實現包合，在掩蓋不良異味的同時能增加親脂性物質的溶解性及穩定性，從而提高生物利用度［9］。本實驗利用β-CD 制備小葉紅葉藤揮發油的包合物，與傳統正交實驗對比，運用響應曲面法從統計學角度出發，能更有效地確定最佳包合條件，進而改善其揮發油的溶解性和穩定性，提高生物利用度。本研究通過顯微鑒定法、薄層色譜法、紫外分光光度法及紅外光譜分析法對揮發油包合物進行鑒定，從而更直觀地觀察包合物的形成，評價包合物的包合效果，最終為小葉紅葉藤的進一步開發利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 藥物與試劑小葉紅葉藤購于廣西德保縣，經廣西中醫藥大學韋松基教授鑒定為Rourea microphylla；無水乙醇（成都科隆化學品有限公司）；無水硫酸鈉（天津博迪化工股份有限公司）；溴化鉀、香草醛、β-CD（分析純，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）。

1.2 儀器98-1-C 型數字控溫電熱套（天津市泰斯特儀器有限公司）；BSA2245 型電子天平（賽多利斯科學儀器北京有限公司）；KQ-500DB 型數控超聲波清洗器（昆山市舒美超聲儀器有限公司）；2X15-3 型恒溫磁力攪拌器（上海思樂儀器有限公司）；UV-2600 型紫外分光光度計（島津儀器蘇州有限公司）；BX53 型熒光正置顯微鏡（日本OLYMPUS）；iS10型紅外光譜儀（美國NICOLET）。

1.3 方法

1.3.1 小葉紅葉藤揮發油提取［10］稱取適量小葉紅葉藤干燥莖葉，剪碎，加入10 倍量純水浸泡1 h。根據2015年版《中華人民共和國藥典》四部通則2204揮發油測定法中的甲法，提取至揮發油油量不再增加，停止加熱后靜置1 h 以上并收集揮發油，加入適量無水硫酸鈉干燥，4 ℃下保存備用。

1.3.2 包合方法的選擇

1.3.2.1 飽和水溶液法 準確稱取β-CD 8.00 g置于圓底燒瓶中，加入10 倍量超純水，加熱使之成為飽和水溶液。轉移至恒溫攪拌器中，緩慢滴入1 mL 揮發油（揮發油和無水乙醇等比例混合），保持400 r/min，50 ℃反應2 h。冷卻至室溫，于4 ℃下冷藏24 h，抽濾，用適量超純水（約30 mL，10 mL/次）洗滌包合物表面未包合的環糊精，40 ℃真空干燥至恒重［11-12］。

1.3.2.2 超聲法 準確稱取β-CD 8.00 g 置于圓底燒瓶中，加入10 倍量超純水，加熱使之成為飽和水溶液。轉移至超聲波清洗器上進行超聲，緩慢滴入1 mL 揮發油，50 ℃下超聲2 h，其余操作同“1.3.2.1”項下“冷卻至室溫”起。

1.3.2.3 研磨法 準確稱取β-CD 8.00 g 置于圓底燒瓶中，加入適當超純水，研磨成團狀，緩慢滴入1 mL 揮發油，研磨2 h，其余操作同“1.3.2.1”項下“冷卻至室溫”起。

1.3.2.4 包合效果評價指標及方法 包合物收率：準確稱量上述方法得到的包合物質量，計算包合物收率。包合物收率（%）=包合物質量/（環糊精質量+揮發油質量）×100%。

空白回收率測定：用移液槍精密量取1.000 mL揮發油，加入適量β-CD，同揮發油測定方法一致，讀取揮發油體積，計算空白回收率［13］。重復實驗3 次，取其平均值。空白回收率（%）=收集的揮發油量/揮發油投入量×100%。

包合率的測定：精密稱取上述包合物適量，置于圓底燒瓶中，加入500 mL 超純水，連接揮發油提取器，置電熱套中加熱，保持微沸狀態至揮發油油量不再增加，讀取揮發油體積，計算揮發油包合率［13］。揮發油包合率（%）=包合物中揮發油量/（揮發油投入量×空白回收率）×100%。

1.3.3 包合條件的優化

1.3.3.1 單因素試驗 以小葉紅葉藤揮發油包合物收率及包合率為測定指標，計算綜合評分。綜合評分=（揮發油包合率/揮發油包合率最高值）×60+（包合物收率/包合物收率最高值）×40［14-15］。采用單因素試驗分別考察β-CD和小葉紅葉藤揮發油的投料比（6，8，10，12，14）、包合時間（1、2、3、4、5 h）、包合溫度（30、40、50、60、70 ℃）對揮發油包合物制備的影響。

1.3.3.2 響應面法對包合條件的優化設計 基于單因素試驗基礎，以揮發油包合率和包合物收率的綜合評分為考察指標，以投料比（A）、包合溫度（B）、包合時間（C）為考察因素。根據Box-Behnken 響應曲面的設計原理，設置3 因素3 水平進行試驗，見表1。

表1 實驗因素水平

1.4 最佳包合工藝的驗證和表征

1.4.1 最優工藝條件驗證 為驗證預測結果的準確性，驗證預測的最佳工藝條件，實驗重復3次，計算綜合評分，比較實測值和預測值，計算偏差值。偏差=（實測值-預測值）/預測值。

1.4.2 包合物表征 顯微鑒別法［16］：取β-CD（A）、β-CD 與揮發油的物理混合物（B）、包合物（C）適量，分別置于載玻片上，滴加少量純水，使其均勻分散，蓋好蓋玻片，顯微鏡下（×100）觀察形態。

薄層色譜法［17］（TLC）：適當修改文獻方法，稱取適量β-CD 于離心管中，加入1 mL 無水乙醇，超聲15 min，離心后取上清液，得樣品I；用移液槍準確移取100 μL小葉紅葉藤揮發油，用無水乙醇等比例稀釋，得樣品Ⅱ；取適量包合物置于揮發油提取器中，重新提取包合物中的揮發油，用樣品Ⅱ處理方法處理，得樣品Ⅲ；將小葉紅葉藤揮發油和β-CD進行物理混合，加入5 mL無水乙醇，與樣品I處理方式處理，得樣品Ⅳ；將包合物與樣品I 處理方法一致，得樣品Ⅴ。用毛細管分別吸取上述樣品溶液，在硅膠G 薄層板點樣，置于乙酸乙酯和石油醚按1∶4 的體積比展開，晾干后用5%香草醛硫酸溶液噴霧顯色，置于105 ℃干燥箱中烘干至顯色清晰。

紫外分光光度計法［18］（UV）：分別取適量β-CD、揮發油、揮發油和β-CD 物理混合物和包合物，加入5 mL 無水乙醇，得樣品Ⅰ～Ⅳ。采用紫外分光光度計在200～400 nm波長范圍內掃描。

紅外光譜法［19］（IR）：將β-CD、揮發油和β-CD的物理混合物和包合物采用KBr壓片后分別作為樣品Ⅰ～Ⅲ；用移液槍量取小葉紅葉藤揮發油10 μL直接滴加在KBr壓片上作為樣品Ⅳ，采用溴化鉀壓片法測定各樣品在4 000～400 cm處的紅外吸收光譜。

1.5 統計學方法利用Design-Expert 8.0.6軟件設計實驗，以綜合評分進行回歸方程擬合及方差分析，判斷數據的差異是否具有統計學意義。

2 結果

2.1 揮發油空白回收率揮發油的平均空白回收率為95%，其RSD 為1.82%。說明β-CD 對揮發油具有一定吸附能力，但影響較小。見表2。

表2 揮發油空白回收率

2.2 包合方法選擇結果顯示，飽和水溶液法、超聲法、研磨法的包合率分別為84.21%、73.68%、63.16%。表明飽和水溶液法和超聲法的包合效果較好。因飽和水溶液法操作簡單易行，故選擇此法作為包合方法。

2.3 單因素試驗通過測定揮發油包合率和包合物收率，計算綜合評分。

1）當投料比過低時，β-CD 不足以包合完全揮發油，導致包合效果低。隨著投料比的增高，包合效果增加。但當比例過高時β-CD 形成聚合物進而阻礙揮發油進入空腔內，從而影響包合率和包合物收率。2）隨著包合溫度的升高，包和效果出現先增高后降低情況。在溫度適宜情況下，主客體分子間能形成穩定包合物，過低溫度使分子運動遲緩，包合效果不佳，過高溫度可能導致分子運動加快，造成包合物脫包現象，且溫度過高，揮發油容易揮發，一定程度上造成損失。3）包合效果一定程度上隨著包合時間的增加而逐漸增大，揮發油作為客體分子，隨著反應時間的延長進入到β-CD 的空腔內以分子間氫鍵結合更緊密，最終形成包合物。當反應時間達到一定時，其包合效果趨于穩定。見圖1。

圖1 單因素試驗結果

為進一步考察最優的包合工藝，選擇投料比為8、10、12 g/mL；包合溫度為40、50、60 ℃；包合時間為1、2、3 h進行響應曲面實驗。

2.4 響應曲面包合條件優化響應曲面法作為一種優化生物過程的統計學試驗設計，可以幫助確定最佳水平范圍，減少試驗組數以減少成本［20-21］。基于單因素試驗結果，根據Box-Behnken Design（BBD）設計模型試驗方案進行響應曲面試驗。利用Design-Expert8.0.6 軟件，進行多因素回歸擬合，建立二次項回歸模型方程，得到方程：綜合評分=94.30+3.76A+3.73B+0.45C+0.78AB-5.97AC+1.36BC-3A2-7.31B2-8.62C2。見表3。

表3 響應曲面試驗設計及結果

二次回歸方程的方差分析結果顯示該模型對小葉紅葉藤會揮發油包合效果的影響極顯著，失擬項P=0.0548，R2=0.9613，C.V.%為2.82，RAdj2=0.9116，說明該模型擬合效果較好，試驗誤差較小，說明該回歸方程對真實值反映較好，該試驗具有較高的可信度及準確性。見表4。

表4 回歸模型方差分析

方差分析結果顯示，一次項中的B、C，二次項中B2、C2和交互項中AC 表現為極顯著（P＜0.01）。說明投料比和包合溫度為影響包合效果的主要因素，包合時間對包合效果影響無統計學意義。響應面曲面圖可直觀反映不同因素交互作用的影響，可見各因素對包合效果的影響程度為：物料比（A）＞包合溫度（B）＞包合時間（C）。見圖2。

圖2 兩兩因素交互作用對綜合評分影響的響應曲面圖

2.5 最佳包合工藝驗證按最佳工藝重復試驗3 次，綜合評分依次為95.20、96.46、96.67 分，平均綜合評分為96.11 分，響應曲面預測的綜合評分為96.63 分，預測值偏差率為-1.48%、-0.18%、0.04%，證明該模型能較好反映各因素與評價指標的關系。

2.6 包合物表征

2.6.1 顯微鑒定法β-CD（A）、β-CD 與揮發油的物理混合物（B）和包合物（C）的顯微成像圖顯示：β-CD 為無色透明的塊狀顆粒，粒度邊緣清晰、體積較大。β-CD 與揮發油的物理混合物，可見部分揮發油附著在β-CD 上，使其整體透明度變低。包合物為不透明黑色團狀物質，包合物中可見粒度小顆粒狀物質，應為未包合的β-CD碎片。包合前后物質形態發生改變，表明包合物新物相形成。見圖3。

圖3 包合物表征電子顯微成像圖（×100）

2.6.2 薄層色譜法 樣品Ⅱ、樣品Ⅲ和樣品Ⅳ在近似位置出現了相同斑點，且Rf 值基本一致。樣品Ⅰ和樣品Ⅴ中沒有出現斑點，說明小葉紅葉藤揮發油包合物已形成，且無或極少量揮發油存在。樣品Ⅱ和樣品Ⅲ表明小葉紅葉藤包合前后揮發油的主要成分變化不大，包合效果較好。見圖4。

圖4 各樣品的薄層色譜圖

2.6.3 紫外分光光度計法 小葉紅葉藤揮發油（樣品Ⅱ）與物理混合物（樣品Ⅲ）的紫外吸收圖譜相似，而包合物（樣品Ⅳ）的紫外吸收與β-環糊精（樣品Ⅰ）相似，但與樣品Ⅱ、Ⅲ的紫外吸收明顯不同，在306 nm處的吸收被遮掩，在250～300 nm處的紫外吸收明顯減弱，表明小葉紅葉藤揮發油進入空腔內，形成穩定的包合物。見圖5。

圖5 各樣品的紫外分光光度圖譜

2.6.4 紅外光譜法 物理混合物與β-CD 的紅外吸收圖譜相似，但其在2295、2926、2870、1171 cm處有較強吸收峰，表現為揮發油相同的吸收峰，說明物理混合物紅外圖譜是β-CD 和揮發油圖譜的疊加。包合物與β-CD 的吸收峰較為相似，包合物中未見揮發油特征吸收峰，表明包合完成。各樣品的紅外吸收圖譜見圖6。

圖6 各樣品的紅外吸收圖譜

3 討論

本研究利用響應曲面法建立了小葉紅葉藤揮發油包合物的二次多項回歸方程，方程擬合性較好。該方法在中藥成分如揮發油、多糖的提取［22-23］、藥物處方設計［24］、化工［25］、生物發酵［26］等多領域均有應用。在考察的包合條件中發現，β-CD和揮發油的投料比和包合溫度對小葉紅葉藤揮發油包合物制備的影響較大，投料比和包合溫度具有極顯著交互作用。優化后的最佳包合工藝為β-環糊精和揮發油投料比為11.88 g/mL，包合溫度為52.8 ℃，包合時間為1.72 h，綜合評分為96.53 分，包合物的預測值和理論值偏差較小，表明響應曲面法設計結果在揮發油包合物制備工藝優化中的重要作用。

通過對小葉紅葉藤揮發油包合物的表征，直觀反應包合后的物質狀態。本研究結果顯示，小葉紅葉藤揮發油和β-CD 包合物是一種新物相，并非直接物理混合后的結果。同時，通過飽和水溶液法制備的包合物，其原本的揮發油氣味被掩蓋，溶解度和穩定性得到較大改善，方便了制劑成型。揮發油經過包合后其釋放速度降低，可以用于制備緩釋劑型，延長作用時間，更好滿足實際用藥的需求。對制得小葉紅葉藤揮發油包合物仍需對其藥理活性以及揮發油包合前后活性的差異做進一步探討。