雙酚芴對斑馬魚神經行為的影響及毒性作用機制

張鵬宇，王寶堃，劉可春，靳夢,*

1.齊魯工業大學(山東省科學院)生物研究所山東省科學院藥物篩選技術重點實驗室，濟南 250103

2.華北理工大學心理與精神衛生學院，唐山 063200

雙酚芴(9,9-bis(4-hydroxyphenyl)fluorine,BHPF)是雙酚A(BPA)的替代物之一，現已廣泛用于塑料產品的生產。因為BHPF能夠較好地替代BPA，所以常用在與食物接觸的材料或容器中，包括飲水瓶、奶瓶和嬰兒水瓶等[1-2]。2018年加拿大聯邦水質指南將BPA水中安全濃度規定為3 500 ng·L-1[3]。研究發現，加拿大淡水樣本的BPA濃度范圍為3.05～1 888.51 ng·L-1，五大湖流域中BPA含量最高的3個流域中，其濃度分別為309.4、217.6和184.2 ng·L-1。另有研究發現[4]，慢性低劑量BPA(50 ng·L-1和500 ng·L-1)暴露能夠影響斑馬魚對復雜環境的適應能力。考慮到BHPF在食品容器加工中的廣泛應用，特別是兒童用品，因此人們格外關注其對環境和健康的潛在影響。在長期使用BHPF飲料瓶的飲水人群血清中檢測到了BHPF，說明BHPF可以從塑料瓶釋放到飲用水中從而進入人和動物體內。此外，Zhang等[5]研究發現，即使在BPA無毒劑量下，BHPF仍可以干擾內分泌，在小鼠體內產生抗雌激素效應。以上研究表明，BHPF可以進入動物和人體內，對生物體健康產生潛在影響，并且BHPF可能具有強于BPA的毒性效應。Jiao等[1]研究發現，BHPF能夠抑制小鼠和豬卵母細胞減數分裂進程，造成卵母細胞內紡錘體組裝異常、微絲構建紊亂、線粒體功能異常、能量水平下降、過氧化物水平升高和早期凋亡發生等。另外還發現BHPF可以通過改變卵母細胞內組蛋白修飾水平和皮質顆粒分布影響卵母細胞質量。

近些年，隨著我國經濟的不斷發展，水環境污染問題日趨嚴重。環境中各種污染物在水體中的積累不僅會對水生生物的生存構成威脅，同時也會對人類的健康造成直接或間接的影響[6]。諸多研究表明[7]，環境污染物可以對生物體的行為以及神經系統造成不同程度的影響。斑馬魚因其體型小、繁殖快、胚胎透明和對水環境的變化十分敏感等特點，被廣泛用于水體環境中污染物毒性的檢測。還因其具有與人類神經系統高度相似的中樞神經系統功能[8]，而被廣泛應用于神經發育和神經毒性研究。在神經發育方面，斑馬魚發育至第5天就能夠自主運動，便于對其行為活動進行實時監測，這一優勢是其他脊椎動物不能替代的。值得注意的是，斑馬魚對于毒性的敏感性在一定程度上高于哺乳動物，表明斑馬魚對于檢測一些低毒或者毒性表現不明顯的物質具有重要意義[9]。本課題組前期基于斑馬魚模型的研究發現[10]，BHPF對下丘腦-垂體-甲狀腺軸產生毒物興奮效應，破壞髓鞘形成。在此基礎上，本論文以斑馬魚成魚為模型，開展黑白箱測試、新型水槽測試和T迷宮測試并對神經發育、自噬和凋亡相關基因進行檢測，探究BHPF的神經毒性和作用機制。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 材料

1.1.1 試劑

RNA試劑盒(RN2802，北京艾德萊生物科技有限公司)；反轉錄試劑盒(近岸蛋白質科技有限公司)；熒光定量PCR試劑盒(RR036A、RR091A TaKaRa公司)。

1.1.2 儀器

斑馬魚養殖系統(Z-A-S5，上海海圣公司)；Zebrabox斑馬魚行為分析儀(Viewpoint公司)；實時熒光定量PCR儀器(13720，羅氏診斷產品有限公司)；C1000 Touch梯度PCR儀(伯樂生命醫學產品有限公司)；超微量分光光度計(NDoneC，基因有限公司)。

1.1.3 動物

野生型成年斑馬魚AB由山東省科學院生物研究所提供，將斑馬魚養殖在水溫28℃的系統中進行培養，每天給予14 h照明∶10 h黑暗的光照交替，早晚定點喂食。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗分組及處理

將野生型成年斑馬魚AB隨機分為3組：空白對照組、0.1 μg·L-1BHPF組、1 μg·L-1BHPF組。設置3個平行組，每組4條，連續給藥3周，每隔24 h換一次藥，給藥后將斑馬魚放置于恒溫28 ℃，14 h光照∶10 h黑暗的魚房進行培養。

1.2.2 行為學檢測

1.2.2.1 黑白箱測試

黑白箱是一個長22 cm寬14 cm高14 cm的長方體水箱。水箱一側用黑色塑料袋在外圍包裹起來，使缸內呈現黑暗狀態，另一側用白紙包裹起來，使缸內呈現較明亮狀態，之后將水箱放置在LED燈箱上，抽出水箱中間的擋板，將斑馬魚放入水箱中，每次一條。斑馬魚放入水箱中先靜置10 min使其適應環境，當斑馬魚游至黑白分界線時開始計時，記錄時間為3 min，觀察和分析成年斑馬魚在黑、白箱中游動的距離和時間。

1.2.2.2 新型水槽測試

新型水槽實驗在一個長22 cm寬14 cm高14 cm的長方體透明水槽中進行，并將其放置在LED燈箱前面。在水箱外壁畫一條中線，將水箱分成上下2個相等的部分，中線以上為上部區域，中線以下為下部區域。將斑馬魚放入水槽中，每次一條，斑馬魚在水槽中靜置10 min使其適應環境，之后當斑馬魚游至水槽中線時開始記錄，記錄時間為3 min，觀察和分析斑馬魚在上、下區域游動的時間和距離。

1.2.2.3 T迷宮測試

T迷宮檢測裝置的起始臂21 cm，長臂20 cm，短臂11 cm，同時有4個6 cm3的深水區，深水區比其他手臂深4 cm，都是由不透明的塑料板組成，深水區是一個不透明的黑色區域，健康斑馬魚更偏好于黑暗深水環境。將T迷宮放置于LED燈箱上，先對每只斑馬魚進行訓練，待斑馬魚游到深水區時，將其撈出換下一條繼續訓練，所有斑馬魚訓練結束后，開始觀察和分析斑馬魚在起始臂、長臂、短臂和進入深水區的距離和時間，每條斑馬魚的實驗時間為5 min。

1.2.3 熒光定量PCR(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)

在行為學檢測后，將每組成年斑馬魚取腦，魚腦按組別放置EP管中，每組取2個魚腦用PBS沖洗2～3次，加入裂解液，在破碎機中充分研磨，使其完全裂解，然后將研磨后的裂解物放入離心機中離心，取上清液。RNA提取后，利用超微量分光光度計檢測不同組別RNA的濃度，檢測得到的結果A260/A280應在2.0～2.5之間；之后立即使用C1000 Touch梯度PCR儀將RNA進行反轉，將反轉得到的cDNA進行稀釋，然后加入相應的引物用實時熒光定量PCR儀對各個基因進行擴增，以rpl13a為內參基因(表1)。Real-time PCR擴增結束后，用2-ΔΔCt相對定量法計算各組基因的相對表達量。

表1 Real-time PCR所需引物序列信息Table 1 Primer sequence for real-time PCR

1.2.4 統計學分析

利用Graphpad prism 7.0軟件對實驗結果進行One-way ANOVA檢驗，以Correct for multiple comparisons using statistical hypothesis testing.(Bonferroni)進行組間比較，并以Mean±SEM表示。

2 結果(Results)

2.1 黑白箱測試結果提示BHPF造成斑馬魚運動能力異常

黑白箱測試結果顯示健康成年斑馬魚更偏好在黑暗區域中運動，且運動能力正常。0.1 μg·L-1BHPF處理后的斑馬魚運動能力下降，而1 μg·L-1BHPF組斑馬魚運動能力有所提高，提示低濃度BHPF可能對斑馬魚運動能力產生更加顯著的影響。與空白對照組相比，0.1 μg·L-1BHPF組和1 μg·L-1BHPF組斑馬魚在黑暗區域的運動距離/總距離、黑暗區域的運動時間/總時間的比值雖有下降趨勢，但不具有統計學意義(圖1)。該實驗結果提示，BHPF能夠導致斑馬魚運動能力異常，但對認知能力無顯著影響。

2.2 新型水槽測試結果提示BHPF引起斑馬魚探索行為異常

新型水槽實驗發現，經BHPF處理后的斑馬魚運動軌跡出現了明顯變化，與空白對照組相比，1 μg·L-1BHPF組斑馬魚在水缸上部區域運動軌跡顯著增加，斑馬魚表現出行為異常(圖2(a))。經過數據統計發現，1 μg·L-1BHPF組斑馬魚在上部區域的運動距離/總距離、上部區域的運動時間/總時間的比值均顯著增加，具有統計學意義(圖2(b)和(c))。0.1 μg·L-1BHPF組斑馬魚在上部區域的運動距離/總距離的比值和上部區域的運動時間/總時間的比值雖都有變化，但均不具有統計學意義。綜上所述，在新型水槽實驗中，BHPF引起斑馬魚探索行為異常。

圖2 BHPF造成斑馬魚探索行為異常注：(a) 新型水槽測試中斑馬魚的運動軌跡；紅線表示快速運動(v>5 cm·s-1)，綠線表示中速運動(2 cm·s-1≤v≤5 cm·s-1)，黑線表示慢速運動(v<2 cm·s-1)；(b) 不同組斑馬魚在水槽上部區域運動距離與在整個水槽內運動總距離的比值；(c) 不同組斑馬魚在水槽上部區域運動時間與在整個水槽內運動總時間的比值；*表示與空白對照組相比差異顯著(P<0.05)。Fig.2 BHPF induced abnormal exploration behavior of zebrafishNote:(a) Zebrafish swimming path in novel tank diving tests;red line indicates fast movement (v>5 cm·s-1),green line indicates medium speed movement (2 cm·s-1≤v≤5 cm·s-1),and black line indicates slow speed movement (v<2 cm·s-1);(b) The ratio of distance (top/total) of zebrafish in novel tank diving tests;(c) The ratio of duration (top/total) of zebrafish in novel tank diving tests;*P<0.05 indicates significant difference compared with blank control group.

2.3 T迷宮測試結果提示BHPF造成斑馬魚學習記憶能力損傷

通過T迷宮測試，探究BHPF對斑馬魚學習記憶能力的影響。與空白對照組相比，0.1 μg·L-1BHPF組斑馬魚在T迷宮中運動軌跡明顯減少，抑制了斑馬魚的運動能力；1 μg·L-1BHPF組斑馬魚運動軌跡顯著增加，出現運動過度活躍現象并且在錯誤臂出現的次數增多(圖3(a))。通過數據統計發現，0.1 μg·L-1BHPF組斑馬魚在錯誤臂的運動距離/總距離、錯誤臂運動時間/總時間的比值均增加，但不具有統計學意義；而1 μg·L-1BHPF組斑馬魚在錯誤臂的運動距離/總距離、錯誤臂的運動時間/總時間的比值均顯著增加，具有統計學意義(圖3(b)和(c))。以上實驗結果提示，BHPF對斑馬魚學習記憶能力造成了損傷。

圖3 BHPF影響斑馬魚學習記憶能力注：(a) T迷宮測試中斑馬魚的運動軌跡；紅線表示快速運動(v>5 cm·s-1)，綠線表示中速運動(2 cm·s-1≤v≤5 cm·s-1)，黑線表示慢速運動(v<2 cm·s-1)；(b) 不同組斑馬魚在T迷宮錯誤臂運動距離與在整個水槽內運動總距離的比值；(c) 不同組斑馬魚在T迷宮錯誤臂運動時間與在整個水槽內運動總時間的比值；*表示與空白對照組相比差異顯著(P<0.05)。Fig.3 BHPF had adverse effects on learning and memory ability of zebrafishNote:(a) Zebrafish swimming path in T-maze tests;red line indicates fast movement (v>5 cm·s-1),green line indicates moderate movement (2 cm·s-1≤v≤5 cm·s-1),and black line indicates slow movement (v<2 cm·s-1);(b) The ratio of distance (wrong direction/whole arena) of zebrafish in T-maze tests;(c) The ratio of duration (wrong direction/whole arena) of zebrafish in T-maze tests;*P<0.05 indicates significant difference compared with blank control group.

2.4 BHPF影響神經發育相關基因的表達

為進一步探究BHPF造成斑馬魚行為異常的神經毒性作用機制，本研究利用qRT-PCR從神經發育、自噬和凋亡3個方面對斑馬魚腦內相關基因進行檢測。與空白對照組相比，低、高濃度BHPF處理組c-fos(c-proto-oncogene protein)、syn2a(synchronous2a)、tuba1b(tubulin alpha-1b chain)、mbp(myelin basic protein)和gfap(glial fibrillary acidic protein)的表達顯著上調，且具有濃度依賴性(圖4)。研究結果提示，BHPF影響斑馬魚腦內神經發育相關基因表達。

圖4 BHPF對神經發育相關基因表達的影響注：與空白對照組相比差異顯著，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。Fig.4 Effects of BHPF on the expression of neurodevelopment-related genesNote:Compared with blank control group,there is significant difference,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001.

2.5 BHPF影響凋亡相關基因的表達

為探究BHPF引起的神經毒性是否與凋亡機制相關，本研究對cytoC(cytochrome C)、apaf1 (apoptotic protease activating factor-1)、bax(bcl2-associated x protein)、caspase8 (cysteinyl aspartate specific proteinase8)、p53 (tumor suppressor gene)、caspase9 (cysteinyl aspartate specific proteinase9)和caspase3 (cysteinyl aspartate specific proteinase3)基因進行檢測(圖5)。與空白對照組相比，0.1 μg·L-1BHPF組apaf1、cytoC、bax、caspase8、p53、caspase9和caspase3表達上調，但apaf1和bax表達差異不具有統計學意義。與空白對照組相比，1 μg·L-1BHPF組apaf1、cytoC、bax、caspase8、p53、caspase9和caspase3表達均顯著上調，具有統計學意義。研究結果提示，BHPF可以調控斑馬魚腦內凋亡相關基因，并且隨著濃度增加，BHPF對基因表達的影響越顯著。

圖5 BHPF對凋亡相關基因表達的影響注：與空白對照組相比差異顯著，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。Fig.5 Effects of BHPF on the expression of apoptosis-related genesNote:Compared with blank control group,there is significant difference,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001.

2.6 BHPF影響自噬相關基因的表達

為探究BHPF產生神經毒性是否與自噬機制有關，對atg5 (autophagyrelated gene 5)、beclin1、ulk2 (unc-51-like kinase 2)和parkin進行檢測(圖6)。與空白對照組相比，0.1 μg·L-1BHPF組和1 μg·L-1BHPF組的atg5、beclin1、ulk2和parkin基因的表達以濃度依賴方式上調，具有統計學意義。研究結果提示，BHPF可以通過影響斑馬魚腦內自噬相關基因從而導致神經毒性。

圖6 BHPF對自噬相關基因表達的影響注：與空白對照組相比差異顯著，**P<0.01，***P<0.001。Fig.6 Effects of BHPF on autophagy related gene expressionNote:Compared with blank control group,there is significant difference,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001.

3 討論(Discussion)

為探究BHPF對環境和生物健康的潛在威脅，本研究以斑馬魚成魚為模型，進行了神經行為學和相關基因檢測，以揭示BHPF誘導的神經毒性和內在機制。黑白箱測試主要對斑馬魚的認知能力進行檢測，健康成年斑馬魚更偏好于黑暗環境，而不喜歡明亮環境；新型水槽測試對斑馬魚探索能力進行檢測，健康成年斑馬魚的探索欲望更強，在水槽上部運動更加活躍；T迷宮測試檢驗斑馬魚的學習記憶能力，健康成年斑馬魚通過訓練能夠減少游到深水區的時間和游到錯誤區的次數。3種行為學測試探究的都是斑馬魚的神經損傷情況，三者之間具有相互作用關系，本研究發現黑白箱測試中BHPF對斑馬魚運動能力產生影響；新型水槽測試顯示BHPF使斑馬魚探索欲望降低，進一步說明BHPF可以對斑馬魚運動能力產生影響；T迷宮測試結果發現，BHPF不僅對斑馬魚運動能力產生影響還會對斑馬魚學習記憶造成損傷。以往研究利用斑馬魚新型水槽測試揭示了BHPF的抗雌激素毒性[11]。T迷宮測試顯示了BPA另一種替代物雙酚AF(4,4’-六氟-2-二酚，BPAF)使斑馬魚在錯誤臂出現次數增加，揭示了BPAF對斑馬魚產生神經毒性效應[12]。Li等[4]研究發現，健康成年斑馬魚與紅色相比更偏好綠色區域，50 ng·L-1BPA處理后的斑馬魚對綠色和紅色沒有明顯的偏好，但運動能力降低；當BPA濃度達到500 ng·L-1時，雖仍然沒有明顯的顏色偏好，但運動開始恢復到正常水平。同樣在紅色與藍色偏好測試中發現，健康成年斑馬魚更偏好紅色區域，50 ng·L-1BPA處理后的斑馬魚對紅色和藍色沒有明顯的偏好，但運動能力降低；當BPA濃度達到500 ng·L-1時，雖然仍然沒有對紅色或藍色的偏好，但運動開始恢復到正常水平。究其原因可能在于低濃度BPA可使血清素陽性神經元數量減少得更加明顯，從而造成斑馬魚運動能力降低。上述行為學測試結果與本研究結果相似，黑白箱測試和新型水槽測試中低濃度BHPF可以對斑馬魚行為運動產生影響，T迷宮實驗BHPF可以對斑馬魚學習記憶產生損傷，提示BHPF誘導斑馬魚成魚的神經毒性。研究發現，BHPF處理組使神經發育、自噬和凋亡相關基因表達顯著上調，這與之前有毒化合物暴露對斑馬魚的影響的研究結果相類似。韓沐汐等[13]研究發現，氯化銻處理的斑馬魚凋亡和自噬相關基因表達顯著上調。又有研究表明[14]，鉛暴露導致斑馬魚神經發育相關基因過表達。本研究的主要目的是探究BHPF對斑馬魚產生的神經毒性及作用機制，但是探討BHPF和BPA的毒性效應差異及內在機制對于水生環境的監測和人類健康發展也是至關重要的。因此，本課題組今后的研究重點將會詳細比較和分析BHPF和BPA的毒性效應差異和內在機制。

c-fos是斑馬魚神經元興奮性的標志物[15]；gfap表達上調可產生神經毒性[16]；tuba1b在中樞神經系統中發揮重要作用；mbp在斑馬魚胚胎發育階段的神經系統中表達豐富。syn2a是哺乳動物突觸形成的生物標志物，在突觸發生和神經遞質釋放中發揮重要作用[17]。本實驗發現，BHPF對c-fos、gfap、tuba1b、mbp和syn2a等神經發育相關基因的表達具有調控作用，上述基因表達上調提示BHPF可能通過影響神經元活動、中樞神經系統結構、突觸的發生和神經遞質釋放產生神經毒性。

細胞凋亡是一種繼發性程序化死亡過程，多種基因參與調控，其中bax是啟動凋亡的關鍵基因[18]，隨著死亡信號的刺激，促凋亡蛋白BAX直接被激活，隨后移位至線粒體并形成同源二聚體通道，促進CYTO C釋放至胞漿導致APAF1活化，從而使CASPASE蛋白激活并誘導細胞凋亡。p53能通過激活促凋亡因子，同時抑制抗凋亡因子增加線粒體通透性并參與凋亡程序[19]。結果發現，BHPF使apaf1、cytoC、bax、caspase3、caspase8、caspase9和p53凋亡相關基因表達上調，提示BHPF可以通過誘導細胞凋亡產生神經毒性。

自噬是細胞進化的正常生理過程[20]，正常生理情況下對細胞有利，在應激刺激時自噬活性升高以應對不利環境。當刺激持續存在時，將會過度激活自噬活性，從而導致細胞的損傷或死亡。atg5基因參與自噬體的形成，在自噬過程中起關鍵作用[21]。beclin1是第一個被發現與自噬調控相關的關鍵因子[22]。parkin作為E3泛素連接酶，能從胞質轉移到線粒體中，泛素化線粒體蛋白，形成自噬體，進而通過自噬降解受損的線粒體[23]。ulk2能阻止不溶性泛素化蛋白聚集物的積累[24]。研究顯示[1]，BHPF可以調控beclin1表達顯著上調，說明BHPF可以誘導線粒體自噬，降解線粒體結構蛋白，這與本實驗結果類似。本研究進一步檢測了atg5、parkin和ulk2自噬相關基因，提示BHPF可能由于造成過度自噬產生神經毒性。

綜上所述，本研究通過行為學檢測(黑白箱測試、新型水槽測試和T迷宮測試)和基因檢測(神經發育、自噬和凋亡)相結合的方法，明確了BHPF對斑馬魚成魚的神經毒性及作用機制，為水生環境的監測和人類健康發展提供了理論基礎。