氰氟蟲腙干擾斑馬魚(Danio rerio)魚鰾的發育

陳鑫，李文華

分子藥物教育部工程研究中心，福建省分子醫學重點實驗室，廈門市海洋與基因工程藥物重點實驗室，華僑大學生物醫學學院，廈門 361021

氰氟蟲腙(metaflumizone,C24H16F6N4O2)是由德國巴斯夫公司開發的一種縮氨基脲類殺蟲劑[1]，它通過阻斷昆蟲中的鈉離子通道，抑制昆蟲的神經活動，從而使昆蟲出現麻痹、癱瘓等癥狀[2]。截至2017年1月底，8個氰氟蟲腙產品在我國獲得批準登記，其中包含2個原藥，6個農藥制劑，主要用于十字花科蔬菜和水稻等作物的病蟲害防治[3]。

氰氟蟲腙對哺乳動物的急性毒性較低(口服LD50>5 000 mg·kg-1·d-1)[4-5]，在長期慢性毒性研究中，氰氟蟲腙對哺乳動物大鼠、小鼠和狗也都表現出較低的毒性，且沒有發現其對哺乳動物具有致癌性[6]。此外，多代生殖毒性研究表明氰氟蟲腙對哺乳動物的后代沒有毒性。然而，氰氟蟲腙對包括魚類和水生無脊椎動物在內的水生物種卻有一定的毒性影響[4-5]。氰氟蟲腙對虹鱒魚(Oncorhynchusmykiss)和鱸鯉(Cyprinodonvariegates)的96 h半致死濃度分別為>0.228 mg·L-1和>0.257 mg·L-1[4-5]。同時，氰氟蟲腙對糠蝦(Americamysisbahia)和東部牡蠣(Crassostreavirginica)的96 h半數效應濃度分別為>0.289 mg·L-1和>0.136 mg·L-1[4-5]。目前尚沒有其他較深入的關于氰氟蟲腙對水生生物毒性及致毒機理等的研究報道。有研究表明，同為縮氨基脲類殺蟲劑的茚蟲威暴露能夠引起斑馬魚出現心包水腫、心率下降及細胞凋亡等現象[7-8]。目前，對氰氟蟲腙的研究主要集中在藥效和藥物殘留等方面，而關于其對水生生物(例如魚類)的毒理學信息仍是有限的。

與此同時，氰氟蟲腙在土壤和水體沉積物系統等生態環境中具有較高環境持久性。歐洲食品安全局曾報道氰氟蟲腙在土壤中的半衰期為141 d，在水體沉積物系統中的半衰期為451 d[4-5]。農藥施用后往往會導致其在土壤和農作物中殘留，同時也會隨著雨水沖刷進入水生態系統[9]。因此，氰氟蟲腙對水生態系統造成的危害不容忽視，而數量龐大的有鰾魚類是水生態系統中的重要生物。魚鰾作為重要的功能器官，其發育及充氣過程極易受到環境污染物的干擾[10]。

斑馬魚作為一種常見的模式生物，目前已被廣泛用于殺蟲劑等農藥的毒性評估[11-12]。在本研究中，將斑馬魚胚胎暴露于氰氟蟲腙(0.1、1和10 μmol·L-1)中，記錄并分析了不同發育時期胚胎的存活率、孵化率和畸形率，同時對斑馬魚幼魚的魚鰾組織進行病理學分析，并對魚鰾發育相關的關鍵標記基因的表達進行深入研究。總體而言，本研究結果將為氰氟蟲腙廣泛使用所帶來生態風險的評估提供更多的毒理學證據。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 化學品和試劑

氰氟蟲腙，分子式為C24H16F6N4O2，CAS No.139968-49-3，純度≥97%，購自加拿大多倫多研究化學品公司；麻醉劑MS-222購自中國上海拜德醫藥科技有限公司。多聚甲醛購自Sigma公司；蘇木素伊紅(H&E)染色試劑盒購自中國碧云天生物技術有限公司；地高辛RNA標記試劑盒(SP6/T7)和抗-digoxigenin-AP Fab fragments購自德國Roche公司；BCIP/NBT顯色試劑盒購自中國碧云天生物技術有限公司；助溶劑二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)為分析純，購自Biosharp公司。

1.2 斑馬魚和氰氟蟲腙暴露

野生型成體斑馬魚(AB品系)飼養于上海海圣公司生產的獨立養殖循環水系統中，水溫保持在(28±0.5) ℃，成魚飼喂新鮮孵化的豐年蝦，每天3次。將成年雌雄斑馬魚(1只雌性和4只雄性)分隔開放在同一產卵箱中過夜，并在第2天燈亮時將隔離板移開讓其追逐產卵。

氰氟蟲腙粉末溶解于DMSO中配制成10 g·L-1的母液，然后避光存放。根據預實驗的結果，設置了3個濃度梯度，分別為0.1 μmol·L-1(低濃度暴露組)、1 μmol·L-1(中濃度暴露組)和10 μmol·L-1(高濃度暴露組)。按照OECD準則[13]，在體視顯微鏡(德國Leica公司，M205FA)下隨機挑選處在囊胚期(受精后3 h)的健康胚胎用于藥物暴露。在90 mm培養皿中，每組隨機放置70個胚胎。每個暴露濃度設置3個平行，空白對照組加入0.05%的DMSO。在整個暴露期間，每天更換一次暴露溶液。

所有實驗方案均得到華僑大學動物保護委員會與福利委員會的批準與支持。

1.3 氰氟蟲腙實際濃度的測定

利用高效液相色譜(德國Agilent公司，Agilent Technologies 1260 Infinity)對培養皿中氰氟蟲腙的暴露濃度進行檢測，每次進樣體積為15 μL。在檢測過程中使用C18柱(4.6 mm×150 mm，5 μm)，流動相為甲醇和水(V∶V=75∶25)，流速為1.0 mL·min-1，檢測波長為285 nm。

1.4 表型分析

在受精后24、48、72和96 h分別記錄斑馬魚胚胎存活率、畸形率，在受精后48、72和96 h記錄胚胎孵化率。同時，在受精后96 h，將斑馬魚幼魚用0.03% MS-222進行麻醉和拍照，使用顯微鏡Leica Application Suite X軟件計算魚鰾的垂直長度和體長(德國Leica公司，LAS X)。

1.5 組織病理學分析

在幼魚麻醉后，取受精后96 h的幼魚(n=12)放置于4%的多聚甲醛溶液中進行固定，然后包埋于石蠟中進行切片。切片的厚度為3～5 μm。伊紅和蘇木素染色(hematoxylin and eosin staining,HE)按照試劑盒內的操作手冊進行。染色完成后使用倒置顯微鏡(德國Zeiss公司，Axio Observer)觀察并拍照。

1.6 胚胎整體原位雜交

設計基因pbx1a[14](GenBank：AJ245962.1)、anxa5b[15-16](GenBank：BC046873.1)、elovl1a[16](GenBank：NM_001005989.3)和hprt1l[17](GenBank：NM_001002056.1)含有T7啟動子的探針引物，引物序列如表1所示。使用地高辛標記的RNA標記試劑盒合成上述基因的RNA探針，具體操作方法見說明書。胚胎整體原位雜交的操作過程按照Thisse和Thisse[18]建立的方法進行。

表1 探針引物序列Table 1 The primers used for probe amplification

簡而言之，將預雜交后的胚胎(每一個探針中的對照組與暴露組各包含10～15個胚胎)與上述反義RNA探針在60 ℃雜交過夜。第2天，使用預熱的梯度雜交緩沖液清洗胚胎并進行封閉，然后，將胚胎孵育在抗體溶液中4 ℃孵育過夜。第3天，使用緩沖液進行洗滌，然后用BCIP/NBT顯色試劑盒進行避光染色。在顯色過程中，注意觀察顯色情況。當顯色完成后使用甲醇進行梯度脫色，脫色完成后將胚胎置于甘油中透化過夜。

1.7 統計分析

本實驗使用Statistic Package for Social Science (SPSS)25.0軟件進行數據統計處理。數據表示為平均值±標準差(Mean±SEM)。氰氟蟲腙處理組和對照組之間斑馬魚胚胎的存活率、孵化率、畸形率以及幼魚魚鰾大小和體長采用單因素方差分析法(one-way analysis of variance,ANOVA)選擇最小顯著性差異法進行統計分析。P<0.05表示具有顯著性差異。

2 結果(Results)

2.1 暴露水體中氰氟蟲腙實際濃度測定

采用高效液相色譜儀檢測了0.1、1和10 μmol·L-1受試組中氰氟蟲腙藥物的實際濃度。氰氟蟲腙0.1、1和10 μmol·L-1處理組對應的水體中氰氟蟲腙藥物的實際濃度分別為(0.091±0.003)、(0.982±0.005)和(10.020±0.034) μmol·L-1。同時，對照組中的氰氟蟲腙實際濃度低于檢測限。

2.2 氰氟蟲腙影響斑馬魚早期發育

為了評估氰氟蟲腙對斑馬魚早期胚胎發育的影響，首先將斑馬魚胚胎暴露于0.1、1和10 μmol·L-1氰氟蟲腙中，暴露周期為4 d。從受精后24 h至受精后96 h，與對照組相比，3個濃度的氰氟蟲腙處理(0.1、1和10 μmol·L-1)都不會影響斑馬魚胚胎的存活率(圖1(a))。然而，最高濃度的氰氟蟲腙(10 μmol·L-1)處理會顯著降低斑馬魚胚胎在受精后48 h和72 h的孵化率(P<0.01，圖1(b))，同時這種高濃度誘導的孵化延遲現象在受精后96 h恢復正常。此外，3個濃度的氰氟蟲腙處理(0.1、1和10 μmol·L-1)在受精后24、48和72 h，都沒有觀察到明顯的畸形現象(例如心包水腫、卵黃囊腫和脊柱彎曲)。然而，在受精后96 h高濃度(10 μmol·L-1)氰氟蟲腙處理后，觀察到幼魚魚鰾充氣不全這一明顯的畸形現象(圖1(c)和圖2(a)～(d))。

圖1 氰氟蟲腙對斑馬魚早期發育的毒性作用注：(a)存活率，(b)孵化率，(c)畸形率；Con代表二甲基亞砜(DMSO)處理的對照組，誤差線表示為至少3次重復的平均值(Mean±SEM)的平均標準誤差；與對照組相比，***P<0.001、**P<0.01。Fig.1 The toxic effects of metaflumizone on zebrafish embryosNote:(a) Survival rate,(b) Hatching rate,(c) Malformation rate;Con represents control,treated with dimethyl sulfoxide (DMSO) only;error bars represent mean standard error of the mean (Mean±SEM) of at least three replicates;compared with the control,***P<0.001,**P<0.01.

圖2 氰氟蟲腙影響斑馬魚幼魚魚鰾發育注：(a)～(d) 對照組、0.1 μmol·L-1、1 μmol·L-1和10 μmol·L-1氰氟蟲腙處理組在受精后96 h幼魚的側面圖，(e) 受精后96 h幼魚魚鰾的垂直長度，(f) 受精后96 h幼魚的體長，(g)～(j) 對照組、0.1 μmol·L-1、1 μmol·L-1、10 μmol·L-1氰氟蟲腙處理組在受精后96 h進行HE染色的幼魚魚鰾矢狀切面；Con表示DMSO處理的對照組；黃圈指示魚鰾位置；(a)～(d) 比例尺=500 μm；(g)～(j) 比例尺=200 μm；與對照組相比，***P<0.001，**P<0.01。Fig.2 Effects of metaflumizone on the swim bladder development in zebrafish larvaeNote:(a)～(d) Lateral views of control,0.1 μmol·L-1,1 μmol·L-1,10 μmol·L-1 metaflumizone-treated larvae at 96 hpf,(e) Swim bladder vertical lengths of larvae at 96 hpf,(f) Body length of larvae at 96 hpf,(g)～(j) Sagittal section of the swim bladders in H&E stained control,0.1 μmol·L-1,1 μmol·L-1,10 μmol·L-1 metaflumizone-treated larvae at 96 hpf;Con represents DMSO treated groups;yellow circle indicates the position of swim bladder;(a)～(d) Scale bar=500 μm;(g)～(j) Scale bar=200 μm;compared with the control,***P<0.001,**P<0.01.

2.3 氰氟蟲腙干擾斑馬魚胚胎的魚鰾發育

利用Leica Application Suite X軟件測量了各組間魚鰾的大小和體長。對照組、低濃度(0.1 μmol·L-1)、中濃度(1 μmol·L-1)和高濃度(10 μmol·L-1)氰氟蟲腙處理組中幼魚的魚鰾平均垂直大小分別為(0.243±0.023) mm (n=31)、(0.243±0.026) mm (n=23)、(0.247±0.033) mm (n=27)和(0.175±0.039) mm (n=41)(圖2(e))。同時，對照組、低濃度、中濃度和高濃度處理組幼魚的體長分別為(4.436±0.086) mm (n=36)、(4.438±0.101) mm (n=28)、(4.418±0.108) mm (n=34)和(4.353±0.127) mm (n=41) (圖2(f))。經過統計學分析，檢測到無論是魚鰾大小還是體長，高濃度(10 μmol·L-1)氰氟蟲腙處理組中都出現了顯著性減少的現象(圖2(e)和圖2(f))。然后，在組織病理學水平上對幼魚魚鰾的變化進行深入探究，HE染色結果顯示高濃度(10 μmol·L-1)氰氟蟲腙暴露改變了魚鰾的整體結構(圖2(g)～(j))。在對照組和低中濃度氰氟蟲腙處理組(0.1 μmol·L-1和1 μmol·L-1)中，觀察到有明顯充氣的魚鰾結構(圖2(g)～(i)，黃圈)，而在高濃度(10 μmol·L-1)氰氟蟲腙處理的幼魚中，魚鰾未充氣且不規則的魚鰾內部填充有大量細胞(圖2(j))。

2.4 氰氟蟲腙影響魚鰾標記基因的表達

為了深入探究氰氟蟲腙對斑馬魚魚鰾發育和充氣的影響，合成了地高辛標記的魚鰾標記基因的探針，采用胚胎整體原位雜交實驗，檢測了氰氟蟲腙處理后魚鰾標記基因的表達水平(圖3)。基因pbx1a在發育早期表達于魚鰾原基[14]，與對照組相比，在受精后36 h中濃度、高濃度氰氟蟲腙處理組(1 μmol·L-1和10 μmol·L-1)的pbx1a表達的藍紫色信號強度明顯減弱(圖3(a)～(d))。

圖3 氰氟蟲腙影響魚鰾發育標記基因的表達圖式注：(a)～(d)基因pbx1a在受精后36 h的表達圖式，(e)～(h)基因anxa5b在受精后72 h的表達圖式，(i)～(l)基因elov1a在受精后72 h的表達圖式，(m)～(p)基因hprt1l在受精后72 h的表達圖式，(a)～(d)和(m)～(p)是側視圖，(e)～(h)和(i)～(l)是背視圖；Con代表DMSO處理的對照組；紅色箭頭指示信號減弱的位置。Fig.3 Metaflumizone impairs the expressions of swim bladder markersNote:(a)～(d) Expression of the pbx1a gene at 36 hpf,(e)～(h) Expression of the anxa5b gene at 72 hpf,(i)～(l) Expression of the elov1a gene at 72 hpf,(m)～(p) Expression of the hprt1l gene at 72 hpf,(a)～(d) and (m)～(p) were lateral views,(e)～(h) and (i)～(l) were dorsal views;Con represents DMSO treated groups;the red arrows indicate the positions where the signals decreased.

基因anxa5b、elovl1a和hprt1l參與魚鰾的間皮層分化[17,19]。胚胎整體原位雜交實驗結果顯示在對照組中基因anxa5b、elovl1a和hprt1l均表達于魚鰾位置(圖3(e)～(h)、圖3(i)～(l)和圖3(m)～(p))。在各個濃度氰氟蟲腙處理組中，anxa5b的表達圖式都沒有發生變化(圖3(e)～(h))；對于基因elovl1a和hprt1l，高濃度(10 μmol·L-1)處理組中這2個基因的表達量顯著下調(圖3(i)～(l)和圖3(m)～(p))。

3 討論(Discussion)

殺蟲劑在使用過程中可能會通過地表徑流或淋洗進入水體，對包括魚類在內的水生生物構成威脅[9,20]。氰氟蟲腙作為縮氨基脲類殺蟲劑，它通過阻斷神經元鈉離子通道來抵御蟲害[1,21]，近來氰氟蟲腙已在多個國家獲得批準登記，并開始廣泛用于農作物病蟲害的防治[22]。目前尚沒有關于氰氟蟲腙對水生生物毒性的相關研究報道。馮青等[7]和俞瑞鮮等[23]報道了與氰氟蟲腙作用機理相同的農藥茚蟲威對模式生物斑馬魚的發育毒性研究，暗示該類藥物流入水環境勢必會對水生生物造成嚴重危害。在本研究中，以斑馬魚為研究對象，將斑馬魚胚胎暴露于氰氟蟲腙中，初步評估了氰氟蟲腙的發育毒性效應，該研究結果將為氰氟蟲腙對魚類的毒性評估提供重要依據。

在本研究中，使用的氰氟蟲腙藥物濃度(0.1、1和10 μmol·L-1)不會引起斑馬魚胚胎或幼魚死亡，但會延遲孵化(圖1(a)和圖1(b))，在畸形方面除在受精后96 h觀察到魚鰾發育畸形之外，在整個暴露過程中均未觀察到常見的心包水腫、卵黃囊腫和脊椎彎曲等現象(圖1(c)和圖2(a)～(e))。魚鰾的發育是受到機體嚴格調控的一個復雜過程，作為有鰾魚類的重要器官，其主要功能是保持浮力、感知聲音和輔助呼吸等[24-25]。魚鰾的發育對化學污染物極其敏感，近年來，越來越多的研究報道稱環境污染物(如重金屬、磺胺嘧啶、雙酚AF和四溴雙酚A等)的暴露會影響魚鰾正常發育并最終引起魚鰾充氣異常等現象[26-30]。幼魚組織病理切片染色結果顯示高濃度(10 μmol·L-1)氰氟蟲腙暴露后有大量細胞填充于未成形的魚鰾結構中，這一現象與環境污染物如重金屬銅或殺蟲劑溴氰菊酯暴露所引起的魚鰾充氣異常現象類似[31-32]。因此，這些結果暗示氰氟蟲腙可能與銅或溴氰菊酯一樣，能特異性干擾斑馬魚魚鰾的發育過程，然而具體影響仍有待進一步探究。

斑馬魚的魚鰾發育過程主要包括3個階段，即出芽階段(受精后36～65 h)、伸長階段(受精后65～96 h)和充氣階段(受精后96～120 h)[19]。基因pbx1a最早于受精后28 h表達于魚鰾原基，是魚鰾早期出芽階段發育調控的關鍵基因之一[14]。經氰氟蟲腙暴露后，中濃度、高濃度氰氟蟲腙(1 μmol·L-1和10 μmol·L-1)暴露組在受精后36 h時pbx1a的表達量都明顯減少(圖3(a)～(d))，暗示氰氟蟲腙暴露后可能在發育早期(受精后36 h)就開始靶向干擾魚鰾發育。同時，雖然中濃度(1 μmol·L-1)氰氟蟲腙暴露在受精后96 h未觀察魚鰾充氣異常，但中濃度(1 μmol·L-1)氰氟蟲腙暴露卻會在發育早期出芽階段影響pbx1a的表達(圖3(c))。基因anxa5b、hprt1l和elovl1a是魚鰾組織間皮層發育過程中必不可少的基因[17,19]。原位雜交結果顯示這些基因在受精后72 h都表達于魚鰾上，并且經高濃度(10 μmol·L-1)氰氟蟲腙處理后上述基因elovl1a和hprt1l的表達量均明顯減少(圖3(i)～(p))。綜上所述，這些結果暗示氰氟蟲腙對魚鰾的影響可能是起始于出芽階段，隨后影響到魚鰾的伸長階段，最后影響魚鰾的充氣過程。根據已有研究報道，在發育過程中出現魚鰾發育受損或充氣不全現象將影響有鰾魚類的游泳性能和沉浮能力，乃至影響后期的生長發育和繁殖等能力[25,33]。因此，氰氟蟲腙對非靶標生物斑馬魚的影響不容忽視。

此外，在本研究中還觀察到氰氟蟲腙暴露后體長略有減少現象(圖2(f))。研究報道氧化鋅暴露同樣會引起斑馬魚魚鰾面積減少或者充氣功能受損，與此同時伴隨著一定程度的由于脊椎彎曲引起的斑馬魚幼魚體長減少現象[34]。因此，推測氰氟蟲腙暴露在干擾斑馬魚魚鰾發育的同時，可能也造成了不同程度的脊椎彎曲從而引起體長改變，然而相關變化的具體原因仍有待進一步分析。

本研究揭示了氰氟蟲腙對斑馬魚魚鰾發育和魚鰾充氣的影響，為水生態環境中氰氟蟲腙的風險評估提供了相關的理論數據支撐。有關氰氟蟲腙暴露干擾斑馬魚魚鰾發育和魚鰾充氣的具體分子機制仍需要進一步的研究。