膠州灣地區貝類的全氟辛酸健康風險評價

于永興，李風鈴,姚琳，郭萌萌，江艷華，耿倩倩，曲夢，譚志軍，李兆新，張曉娜

1.中國海洋大學海洋生命學院，青島 266000

2.農業部水產品質量安全檢測與評價重點實驗室，中國水產科學研究院黃海水產研究所，青島 266071

全氟辛酸(perfluorooctanoic acid,PFOA)，是一種含有8個碳原子烷基鏈為基本支架的全氟化合物[1]。PFOA具有較強的疏水、疏油和抗高溫等優勢，是不粘鍋、餐具和包裝紙等多種食品接觸材料生產過程中的一種重要加工助劑[2]。PFOA是一類新型持久性有機污染物(persistent organic pollutants,POPs)，具有POPs的典型特征(持久性、蓄積性、遷移性、高毒性)，對人體具有一定的危害[3]。美國規定2010年排放量減少95%，2015年實現完全淘汰；歐盟規定自2020年7月起不得投放入市場[4]。然而在當前的檢測過程中，許多水源、生物體乃至南北極地區都有PFOA檢出[5]。

本研究選取的研究對象為雙殼貝類。雙殼貝類具有獨特的生理特性，營底棲生活，濾食浮游生物，相比海洋生態系統中的其他物種更易蓄積水體中的污染物[6]，通過生物放大作用使得污染物隨著食物鏈進入人體[7]。

美國環境保護局(United States Environmental Protection Agency,US EPA)構建了一個非致癌健康風險評價模型，HR=EDI/RfD，式中：HR為危害系數(hazard ratio)，用以表示風險商值，若該值>1，則表示對人體具有潛在的健康風險；EDI為估計的每日攝入量(estimated daily intake)，即單位體質量的人體預估的每日攝入污染物的劑量(μg·kg-1·d-1)；RfD為參考劑量(reference dose)，即一生的時間之中持續慢性暴露但不產生明顯的負面效應的臨界劑量[8-10]。生物利用度過程指污染物從口腔開始進入人體，止于血液吸收。它實際上包括了2個主要部分，消化系統的溶解和細胞吸收。前者又可稱為生物可給性(bioaccessibility,BA)，是可溶解在消化系統內的最大濃度[11-12]。全氟類化合物主要與生物體內的蛋白質結合，胃作為機體消化蛋白質存在的主要場所，胃消化過程對PFOA在人體的釋放起著至關重要的作用[13-14]。因此有必要對貝類中PFOA在胃消化過程的生物可給性進行研究。

膠州灣是以薛家島(36°00'53″N,120°17'30″E)和團島(36°02'36″N,120°16'49″E)相連為界的半封閉海灣，一部分與黃海相通，位于山東半島的南岸。該處海水營養豐富，海水養殖業發達，是重要的海水養殖區[15-16]。青島是膠東半島的一個重要海濱城市，作為中國的新一線城市，擁有950萬常住人口，150萬流動人口，人口數量眾多，水產品消費量較大。據統計，菲律賓蛤仔(Ruditapesphilippinarum)、紫貽貝(Mytilusedulis)、扇貝(Chlamysfarreri)、牡蠣(Crassostreagigas)和螠蟶(Sinonovaculaconstricta)等是青島較為重要的貝類品種[17]，在養殖量、市場消費量以及貿易出口等方面均具有重要的地位[18-19]。近年來，水產品質量安全屢出狀況，包括貝類產品在內的食品安全一直是消費者關注的問題。因此，有必要針對以上5種經濟貝類中的PFOA污染情況進行考察，并開展健康風險評價，以期提出健康食用指導值。

基于以上考慮，本研究圍繞膠州灣海域，分別于市南區、市北區、紅島、膠州區、黃島和薛家島選取人流量較大、當地居民消費量較高的6個大型農貿市場設置不同取樣點。它們分別是新貴都市場、河西農貿市場、紅島海鮮專賣、周家村市場、劉公島市場和薛家島愛心市場，以此對典型經濟貝類中的PFOA蓄積量進行摸底。同時參考青島市國民體質測定結果報告[20]劃分的年齡段，且在本地區中青年人和老人是水產品攝入的重點人群這一現實情況，將20～60歲中每10歲劃為一個年齡段，60歲以上作為一個年齡段，在不同性別消費群體中以調查問卷方式開展膳食調查。隨后進行PFOA的生物可給性研究，綜合利用以上數據，計算PFOA的健康風險值，為膠州灣地區居民貝類的健康食用提出建議。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 樣品采集

在膠州灣海域沿線選擇人口較為集中、水產品消費量較大的6個集貿市場設置取樣點(圖1)。每個取樣點采集約30只新鮮貝類(菲律賓蛤仔、紫貽貝、扇貝、牡蠣、螠蟶)，并置于預先盛放海水的水箱中暫存。回實驗室后立即解剖，取可食用部分，液氮研磨，并保存于-80 ℃冰箱。6個取樣點如圖1所示，1號為新貴都市場，2號為河西農貿市場，3號為紅島海鮮專賣，4號為周家村市場，5號為劉公島市場，6號為薛家島愛心市場。

圖1 取樣點示意圖Fig. 1 Diagram of sampling points

1.2 貝類樣品中PFOA殘留量的測定

1.2.1 樣品的前處理

各樣品于真空冷凍干燥機(CoolSafe 55-9，丹麥Scanvac)中72 h完全凍干。準確稱取0.2 g凍干樣品于10 mL PP離心管中，每個離心管中加入2 ng內標物MPFOA，然后室溫靜置12 min。加入4 mL 90%乙腈水溶液，渦旋至完全混勻，超聲提取10 min，保證組織中的PFOA徹底釋放。8 000 r·min-1離心10 min后，移取1 mL上清液潤洗Oasis PRIME HLB固相萃取柱，保持流速為1～2滴·s-1。潤洗液流干后，再準確移取2 mL提取液加載至SPE小柱上，保持流速同上，收集流出液。于35 ℃氮氣下吹至略低于0.5 mL，該過程大約1 h。用50%甲醇水溶液定容至1 mL，12 000 r·min-1高速離心10 min，將液體收集于閉口上樣小瓶中，-80 ℃保存，待測。

1.2.2 液相色譜質譜條件及質控

液相色譜質譜條件參考文獻[21]的方法。其中，流動相：A為5 mmol·L-1乙酸銨水溶液，B為甲醇。質譜中PFOA的定性離子對為413/169，定量離子對為413/369。為了防止實驗器材對背景值的干擾，實驗器材均不選取含有聚四氟乙烯的實驗器材，轉而使用聚丙烯材質，且于前處理實驗前一天預先經過甲醇和超純水充分沖洗，晾干。樣品檢測的同時進行空白對照實驗，所有實驗數據均扣除空白值。以信噪比等于3為界確定檢出限。PFOA的標準曲線相關系數為0.99958，曲線的線性范圍為0.100～20.0 μg·L-1，樣品檢出限為0.03 ng·kg-1，加標回收率為97.4%。

1.3 PFOA生物可給性分析

1.3.1 體內消化模擬實驗

取2 g樣品，置于18 mL離心管中，加水混勻，用1∶1鹽酸調節pH=2.0。15 min后，使pH依然保持2.0。每個離心管加入0.1 mL新鮮配制的胃蛋白酶溶液。該溶液由胃蛋白酶0.1 g，加0.1 mol·L-1的鹽酸l mL，混勻制得。將離心管置于37 ℃水浴振蕩器中，120 r·min-1下振蕩2 h，進行胃液模擬消化。

取上述胃消化液至聚丙烯離心管中，放置于4 ℃離心機中，12 000 r·min-1離心30 min。收集上清液。此上清液所含PFOA即為胃液中人可吸收利用的最大PFOA濃度[22-23]。

1.3.2 樣品處理

取0.5 mL上述上清液，加入3 mL ddH2O，渦旋1 min，振蕩15 min，充分混勻。4 ℃條件下離心30 min，轉速為8 500 r·min-1。預先把Oasis HLB(30 μm)的固相萃取柱依次經過3 mL甲醇、3 mL去離子水進行活化。取1.3.1中所得上清液過柱，再用3 mL 10%的甲醇水溶液充分淋洗，棄去。準確吸取3 mL甲醇洗脫目標物，控制流速為1～2滴·s-1。洗脫液渦旋混合，0.2 μm微孔濾膜過濾1 mL至上樣小瓶，待測。HPLC-MS條件同1.2.2。

1.3.3 生物可給性(BA)

計算公式為BA(%)=消化液中PFOA的總量(ng)/樣品中PFOA的總量(ng)[24]。消化液中PFOA的總量即可利用的PFOA總量，等于消化液中PFOA的濃度乘以消化液總體積。樣本中PFOA的總量等于樣本中PFOA的蓄積量和樣品質量的乘積。本研究設置了純清水組作為空白對照，計算修正值。

1.4 儀器和試劑

LC-20A超高效液相色譜儀(Shimadzu，日本)；QTRAP 5500三重四極桿復合線性離子阱質譜儀(AB Sciex，美國)；N-EVAP 112氮吹儀(Organomation，美國)；冷凍離心機(3K15，德國Sigma)；57250-U固相萃取裝置(Supelco，美國)。

PFOA標準品(Sigma，美國)，MPFOA(Wellington，加拿大)，甲醇、乙腈、超純水(質譜級，Sigma，美國)，Oasis PRIME HLB固相萃取柱(6 mL,200 mg,Waters，美國)。

1.5 膳食調查

根據經濟貝類主食區域消費主體特點，設計了膳食調查紙質調查問卷，于各采樣點及周邊區域隨機分發。調查問卷的內容主要包括姓名、性別、年齡區間(20～30歲、31～40歲、41～50歲、51～60歲和61歲以上)、家庭用餐人數、每月食用貝類(菲律賓蛤仔、紫貽貝、扇貝、牡蠣和螠蟶)的頻次(一個月1次、一個月2～3次、每周次數)和每次的購買量(kg)，飲食時是否伴有佐食和其他補充說明。

1.6 風險商

HR=(EDI×BA)/RfD

EDI=單位體重的居民每日貝類膳食量(kg·kg-1·d-1)×貝類中PFOA蓄積量(以干質量計)(μg·kg-1)

1.7 數據分析

數據分析軟件采用GraphPad Prism 9、SPSS 22.0和Excel 2020。樣品中PFOA含量以干質量計，含量低于檢出限的或未檢出的以0計入。

2 結果(Results)

2.1 膠州灣貝類中的PFOA蓄積量分析

不同取樣點5種貝類的PFOA蓄積量如表1所示。調查顯示，薛家島、劉公島等處的貝類產品中PFOA含量較低，而來源于新貴都、河西以及周家村等處的產品中PFOA含量稍高。對于不同品種的貝類來說，菲律賓蛤仔和扇貝中的PFOA蓄積量相對較高，明顯高于其他品種。來源于不同采樣點的菲律賓蛤仔中PFOA蓄積量范圍為0.17～3.09 μg·kg-1，扇貝中PFOA蓄積量范圍為0.23～3.36 μg·kg-1。

表1 不同取樣點5種貝類的全氟辛酸(PFOA)蓄積量Table 1 Accumulation of perfluorooctanoic acid (PFOA) of 5 shellfish speices in different sample points (μg·kg-1)

2.2 不同貝類中的PFOA生物可給性

根據貝類樣品中的PFOA蓄積量測定結果推算出2 g貝類樣品中PFOA的含量。根據1.3.3中的方法，體外模擬胃消化過程，測定出樣品中人體可利用的PFOA總量。進而計算得到PFOA的生物可給性(表2)。

如表2所示，不同貝類中的生物可給性從16.7%(蛤仔)到41.9%(螠蟶)，證明了隨著貝類產品進入人體的PFOA不會經過胃消化過程全部進入消化液中而被人體吸收。與Li等[25]通過生物利用度提取模型(physiologically based extraction test,PBET)的方法測得的9.8%～99%結果一致。取以上貝類品種中的生物可給性均值即26.9%，進行健康風險評價。

表2 5種貝類胃消化過程中PFOA的生物可給性Table 2 Bioaccessibility of PFOA in 5 shellfish species by digestive process of stomach

2.3 膳食調查的結果

在針對膠州灣地區居民開展的貝類膳食調查中，共計100份有效數據被采集。

根據調查結果，膠州灣地區居民總體平均貽貝膳食量為0.05 kg·kg-1·d-1，牡蠣0.13 kg·kg-1·d-1，扇貝0.08 kg·kg-1·d-1，螠蟶kg·kg-1·d-1，菲律賓蛤仔0.14 kg·kg-1·d-1(表3)。受調查群體普遍對螠蟶的膳食量較小，在5種貝類中攝食比例僅占4%。對牡蠣和菲律賓蛤仔的膳食量較高，占30%及以上，其次為扇貝，膳食量占比為21%(圖2)。另外，在本次受調查群體中，男性人員占51%，女性為49%。而結果顯示，受調查群體的性別對于貝類品種的選擇并無傾向性。然而，年齡對于品種的喜好性具有明顯的差異：中青年人群(20～60歲)偏好貽貝，而老年人群(60歲以上)更偏好菲律賓蛤仔(圖3)。

圖2 膠州灣地區不同性別居民5種貝類的膳食比例Fig. 2 Dietary proportion of 5 shellfish species among residents of different genders in Jiaozhou Bay

圖3 膠州灣地區不同年齡居民5種貝類膳食比例Fig. 3 Dietary proportion of 5 shellfish species among residents of different ages in Jiaozhou Bay

表3 膠州灣地區居民5種貝類每日平均膳食量Table 3 Daily average intake of 5 shellfish species in Jiaozhou Bay (kg·kg-1·d-1)

2.4 風險商值的計算

風險商值根據1.6中的公式進行計算，RfD選用小鼠中的數值，0.33 μg·kg-1·d-1[26]。青島市居民平均體質量為60 kg左右。綜上，經研究，膠州灣地區貝類中的PFOA風險商值較小，HR均<1，數量級在10-3～10-5之間(表4)。

表4 膠州灣地區5種貝類的PFOA風險商值(HR)Table 4 The harzard ratio (HR) of PFOA from 5 shellfish species in Jiaozhou Bay

3 討論(Discussion)

膠州灣是典型的半封閉型海灣，其灣口有多條河流匯入，并直接進入黃海。因此，膠州灣也是各類陸源排放物的入海必經途徑之一。2019年青島市貝類產量達73.4 t，膠州灣是最大的主產區之一。然而，近年來，人類活動日益增加，部分河口污染嚴重，膠州灣海域養殖能力趨于下降。貝類的質量安全與品質亟待評價。鑒于此，基于前期的研究數據[26]，開展了典型經濟貝類中的PFOA健康風險評價。

在本次研究中，沿膠州灣沿線，選擇了6個不同區域的采樣點，并確認采樣點的樣品均來自附近海域。樣品采集范圍覆蓋面廣，采集量大，保證了樣品數據的準確性。本研究表明，菲律賓蛤仔和扇貝中的PFOA蓄積量相對較高，明顯高于其他品種，這與崔文杰等[27]的研究結果相似。然而，多年來的研究表明，貽貝對于海洋中的污染物具有較突出的富集能力，已被多個國家用于海洋污染監測的指示品種。在本研究中，貽貝中的PFOA含量并沒有特別突出。推測主要可能是貽貝對于PFOA并沒有特異性的富集效應，同時對于此類物質具有相對突出的解毒能力[28-29]，由于本次采集樣品均為市場購買，樣品均經海水短暫凈化，體內的PFOA具有一定的代謝及清除，因此導致貽貝體內的PFOA含量并未十分突出。此外，近年來的研究表明，無論在植物、哺乳動物或是在魚類體內，均發現對PFOA的蓄積能力與生物體本身的蛋白質含量和游離脂肪酸含量有關。蛋白質含量低則意味著和PFOA結合的概率也降低，因此蓄積能力也下降。而游離的脂肪酸是通過競爭結合位點的方式影響外源物質和內源物質的結合，進而影響PFOA的蓄積。貝類中是否也存在如此機制，亦或是海水的污染是否對貝類的品質產生了一定程度的影響，降低了游離脂肪酸和蛋白質的含量，進而導致其污染物的蓄積能力下降，還有待于進一步的探究[30-31]。此外，由表1可知，同一種貝類不同農貿市場來源之間的PFOA累積量也有較大區別，這可能與不同水質和養殖環境有關，將進一步展開研究。在本次膳食調查中，發現消費者的性別對于飲食習慣沒有明顯的影響，而年齡的不同使得攝食喜好略有差別。然而，調查亦發現，膠州灣地區不同海域的居民飲食習慣本就有地域性差異。如紅島地區盛產優質牡蠣，本地區居民的牡蠣攝食量明顯高于其他品種。另外，海產品尤其是貝類的攝食量或攝食頻率具有季節性差異，貝類生長繁殖的旺季其市場銷量明顯上升。本次膳食調查開展時間為4—6月，為貝類銷售的淡季轉入旺季的時期，收集到的數據相對客觀、準確。

基于上述結果，進一步計算了貝類中PFOA的生物可給性及風險商值。其中，選擇可靠的RfD值至關重要。然而，眾多的環境保護機構各自開展毒理學實驗并進行建模，最終得出的RfD值差異很大。目前，US EPA的研究數據權威性較高，其針對PFOA的RfD為0.33 μg·kg-1·d-1，已被眾多科研人員采用[32-34]。因此，本研究采用了該RfD值。然而，隨著污染物的日益增多，健康風險評價的結果愈加需要準確、客觀。因此，在今后的健康風險調查中，建議綜合采用多家權威機構的多套毒理學數據，建立更加精確的數學模型，以優化RfD值的準確性。Pachkowski等[35]從免疫毒性這一角度出發，對PFOS的RfD進行推導。Chou和Lin[36]利用PBPK模型和貝葉斯曲線對PFOS的RfD進行了修正，修正值介于多家權威機構給出的建議值之間，該運算方式已用于其他全氟烷基類物質的RfD推導，PFOA的RfD推導亦可參考。根據US EPA提供的PFOA的RfD值，對本次調查樣品進行了生物可給性的計算，發現其范圍在16.7%～41.9%之間。風險商值均在10-3～10-5數量級之間，HR值遠<1，與以往的研究結果類似[37]。可見膠州灣地區貝類中的PFOA健康風險較低，可以放心食用。

本文僅對貝類中蓄積量相對較高的PFOA進行了健康風險評價。海洋環境中存在著幾十種全氟類化合物的污染。不同類型的全氟類化合物或與其他類型的污染物之間可能會加強或拮抗污染物的健康風險，這需要進一步開展聯合風險評價研究。

面對全球趨于惡化的海洋生態環境以及POPs種類的日益增加，建議相關部門加強管理，開展近海海域環境及生物樣品中全氟類污染物的定期監測，加快推進高效、靈敏的防控預警技術研發，加強不同類型污染物的聯合風險評價研究。綜上，本研究對建立全氟類化合物的健康風險評價模型，使得海洋環境中的全氟化合物污染可防可控，為海洋養殖業的健康綠色發展起到一定的積極作用。